王婉卿 王 伟 王 雷

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学第二附属医院，山东 济南250001）

椿根皮，又名椿皮、樗白皮，即苦木科植物臭椿Ailanthus altissima（Mill.）Swingle的干燥根皮或干皮。其性味苦、涩、寒，入大肠、胃、肝经，具有清热解毒、燥湿止带、收敛止血、涩肠止泻的功效，临床上常用于治疗赤白带下、崩漏等妇科病症以及湿热泄泻、泻痢不止、便血等消化道病症［1］。现代研究证实其作用主要有抗病毒、杀菌、解热、消炎、抗疟疾、抗癌等［2］，在治疗阴道炎、子宫颈及内膜炎、滴虫性阴道炎、女阴炎等妇科疾病以及因细菌感染引起的痔疮、结肠炎等消化系统疾病方面疗效显著。

目前关于椿根皮药用价值的研究主要局限于其抗病毒、抗肿瘤、杀虫的作用，至于椿根皮对细菌、真菌的抑制作用，研究方向也集中于对其特征性生物碱的分离提纯［3］，而对椿根皮的整体抑菌性研究目前尚未见详细报道；关于椿根皮抑菌成分的提取方法亦无系统的研究结论；药典对椿根皮治疗相关疾病的用量规定也与古籍效方差异较大。综合中医对椿根皮能清热解毒、收涩止带、燥湿止泻的药效认识，以及现当代研究确定其药用成分具有解热、驱虫［4］、消炎、杀菌、抗病毒的作用，笔者将通过纸片扩散法对椿根皮的水提物、50%醇提物、70%醇提物、80%醇提物及95%醇提物的抗菌效果进行比较，确定其抑制菌种，进一步开拓和证实椿根皮抑菌性最显著的活性成分，探索椿根皮水提物和不同浓度的醇提物的最佳提取工艺，为开发抑菌类新药以及椿根皮治疗细菌感染的相关临床应用提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 游标卡尺；计时器；水煎锅；旋转蒸发仪；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵；冻干机；恒温水浴箱；离心机；数控超声波清洗器；十万分之一电子天平；恒温培养箱；超净工作台。

1.2 药物与试剂 椿根皮饮片；乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯化钠（天津市富宇精细化工有限公司）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；琼脂粉（北京奥科斯生物技术有限责任公司）；NaOH（国药集团化学试剂有限公司）；HC（l国药集团化学试剂有限公司）；麦芽膏粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯霉素；大肠杆菌（Eco）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Sau）、绿脓杆菌（Pae）、白色念珠菌（Cal）（均由山东中医药大学实验中心提供）

1.3 椿根皮提取物制备 1）不同浓度醇提物的制备。清洗药材，晾干，粉碎，过筛；定量称取椿根皮生药4份，分别加入95%、80%、70%、50%乙醇，按照料液比为1∶10进行提取，过滤，3 000 r/min离心，取上清液，并进行浓缩至浸膏［5］备用。2）水提物的制备。粉碎药材，定量称取并水煎提3次，每次2 h，过滤；滤液以3 000 r/min离心10 min，取上清液并浓缩至适量（0.5 g生药/mL），高压灭菌后密闭封装，4℃备用。

1.4 纸片扩散法实验 1）无菌纸片及阳性对照、阴性对照纸片的制备。打孔器将新华1号滤纸制备为直径6 mm的圆形纸片，取50片放入一清洁干燥的锥形瓶内，瓶口以棉塞密闭后，用双层报纸进行包扎。121℃高压灭菌30 min，再置于100℃干燥箱内烘干放凉备用［6-8］。阳性对照药为青霉素，将其稀释成100 μg/mL置于灭菌青霉素瓶中，将用于阳性对照的纸片干燥后置于其中浸泡4 h，37℃干燥1 h后备用。阴性对照纸片滴加相应组别的溶剂（超净台紫外灭菌）备用。2）菌种活化。将试验菌菌种用接种环从保存菌种的培养基上挑取并划线接种于多根斜面培养基上［9］，本次实验采用二代菌种，菌种的保存是于4℃下保存。3）菌悬液制备。用接种环刮取新鲜菌落悬浮于10 mL 0.9%氯化钠注射液（121℃高压灭菌15～20 min）中混匀，稀释至菌液浓度为2×105、2×106cfu/mL。4）培养基制备。（1）营养琼脂培养基的制备。营养琼脂培养基的配制比例为牛肉膏0.5 g/100 mL，氯化钠0.5 g/100 mL，蛋白胨1 g/100 mL，琼脂粉2 g/100 mL。按上述比例配制营养琼脂培养基并加入相应比例的蒸馏水溶解，将以上材料煮至微沸，趁热用NaOH（2 mol/L）将pH调至7.0并用pH试纸鉴定其酸碱度［10］。培养基冷却至50℃后，在无菌操作台中向培养皿倾倒培养基。倒入培养皿中的液态营养琼脂培养基应当完全自然覆盖皿底，厚度为4 mm（允许±1 mm误差）。每次制成培养基平板均需检定后再使用，新制平板培养基其含水量多而不利于药敏试验数据的准确性，应待培养基冷却凝固后倒扣于37℃恒温培养箱中培养24 h。若24 h后培养基平板没有长菌则可以用于药敏试验。（2）麦芽汁培养基的制备。麦芽汁培养基的配制比例为麦芽膏粉130 g，琼脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 000 mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH值约为（6.0±0.2），分装三角瓶，115℃高压灭菌15 min，待冷却至55～60℃时，按照上述营养琼脂培养基的操作方法进行分装。然后放置于27℃恒温培养箱中，培养24 h。24 h后培养基平板没有长菌则可以使用。

1.5 抑菌环实验 在超净工作台中，将吸取校正的菌悬液200 μL滴于培养基（细菌选取营养琼脂培养基，真菌选取改良马丁培养基）表面，用摊涂棒涂抹均匀，每次旋转平皿60°，在平皿周边涂2圈，保证均匀涂布。用灭菌的加样枪分别加入10 μL的稀释成1、0.5、0.25、0.125 mg/mL质量浓度梯度的椿根皮50%醇提物，分别滴于4张无菌纸片上，每种溶液重复3次，待纸片干后将同浓度的纸片分别贴于同一培养基的四周，一张阴性对照纸片（其滴加的药品为无菌生理盐水）贴于中央，各纸片距离＞24 mm，与平皿边缘＞15 mm。按上述方法共制备成4个椿根皮50%醇提物纸片培养基，且4个培养基的纸片药物质量浓度呈加倍梯度变化。按照上述方法对稀释为同样浓度梯度的椿根皮70%醇提物、80%醇提物、95%醇提物和水提物也用加样枪分别加至相应的纸片，并待晾干后贴至相应的培养皿。将阳性对照纸片贴于各菌种单独制备的相应培养皿中作为阳性对照，其纸片贴敷方法为四周贴阳性对照纸片，中间贴阴性对照纸片（其滴加的药品为无菌生理盐水）。37℃恒温培养箱培养18～24 h（真菌放置于27℃恒温培养箱培养24 h）后测量抑菌圈的大小，所有结果取平均值计算。纸片一旦接触琼脂不应再移动位置。纸片平板应在15 min内翻转，在恒温培养箱中平板最多2个叠起，确保受热均匀。观察一系列浓度的样品滤纸片周围抑菌环的有无，用游标卡尺测量抑菌环直径，确定MIC。用游标卡尺测量抑菌环直径，结果取平均值，抑菌环直径＞7 mm者计为有抑菌作用，≤7 mm者计为无抑菌作用，3次重复试验均达到有抑菌作用结果者，判为合格。阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。

2 结 果

椿根皮不同提取方法得到的提取物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal有不同的抑菌效果（见图1），其中对Sau抑菌效果最好，椿根皮醇提物最小抑菌质量浓度为0.125 mg/mL，而椿根皮水提物的最小抑菌质量浓度为0.25 mg/mL。椿根皮各质量浓度醇提物和水提物对沙门氏菌无抑菌作用。所有阴性对照组菌株均正常生长，没有抑菌环。椿根皮水提物及各浓度醇提物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal的MIC结果详见表1，椿根皮水提物及各浓度醇提物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal的抑菌结果详见表2。

图1 椿根皮提物及各浓度醇提物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal的抑菌效果

3 讨 论

实验结果表明椿根皮水提物对Sau及Cal有一定抑杀作用，对Eco、沙门氏菌和Pae均无抑杀作用。椿根皮醇提物因浓度不同，对Sau、Eco、Pae和Cal有不同程度的抑杀效果，但在抑杀沙门氏菌方面，只有95%椿根皮醇提物有较明显的抑菌作用。朱玉凤等的研究结果表明，椿皮水提取物能微弱抑杀Sau而不能抑杀Pae、Eco［11］；陈元坤等研究称臭椿皮水煎液对 Eco、沙门氏菌无抑菌作用，对葡萄球菌有一定抑制作用［12］。本实验结果与上述两点研究结果较为一致，同时本实验也证实了椿根皮醇提物在针对Sau、Eco等常见菌种的抑杀方面其效果要优于椿根皮水提物的抑菌效果。尤其是针对椿根皮水提物无法抑杀的Eco和Pae，70%和95%椿根皮醇提物的抑菌效果均比较显著。这一实验结果为研制椿根皮抑菌方面的新药无疑提供了新的研究方向和开发领域。至于95%椿根皮醇提物在1 mg/mL质量浓度下对沙门氏菌有一定的抑菌作用的实验结果，由于与以往研究文献略有出入，还需要进一步开展对照实验分析其重复性和稳定性。

表1 椿根皮水提物及各质量浓度醇提物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal的MIC结果

实验结果还表明，在不同质量浓度的椿根皮醇提物抑菌效果的比较中，椿根皮95%醇提物和80%醇提物的抑菌效果更佳；研究表2可以发现，浓度较高的醇提物其抑菌效果略优于浓度较低的椿根皮提取物。因此，可以推断椿根皮的抑菌部位多为醇溶性成分，而95%醇提物中有效成分纯度较高，效果较好；80%醇提物抑菌谱较广泛，在椿根皮多种质量浓度的醇提物中抑菌效果略优。但醇提物的乙醇浓度与抑菌效果并非正相关，这一点在椿根皮醇提物对Eco和Pae的抑菌效果的表现上尤为突出。本项目的实验结果显示，70%椿根皮醇提物对上述两个菌种的抑制效果比80%椿根皮醇提物更为显著，这可能与70%椿根皮醇提物对菌种的特殊选择性有关，也可能与抑杀Eco的有效成分（如苦木生物碱［13］）在70%乙醇中溶解度较高有关。

表2 椿根皮水提物及各质量浓度醇提物对Sau、Eco、沙门氏菌、Pae和Cal的抑菌结果

另外通过统计学分析可以发现当质量浓度从1 mg/mL减为0.5 mg/mL时，椿根皮提取物的抑菌效果下降比其他相邻浓度差对抑菌效果的影响更为明显。因此，在实验研究影响临床用药时，这一数据可以给予药品开发者更有意义的研究思路。

椿根皮对Sau、Eco、Pae和Cal均有抑杀作用，用椿根皮治疗阴道炎、子宫颈及内膜炎、滴虫性阴道炎、女阴炎等妇科病及因细菌感染引起的痔疮、结肠炎、久痢久泄、肠风便血［14-16］等消化系统疾病有一定科学依据。椿根皮醇提物的抑菌效果优于水提物，因此在开发与椿根皮提取物相关的抑菌产品时，在椿根皮醇提方法与成分分离方面进一步开展研究，可以想见其较广泛的应用前景。但是关于椿根皮确切的抑菌活性，还有待进一步开展体内抑菌试验研究加以证实。