裴怀弟，林玉红，李 琦，李淑洁，张艳萍

（甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州 730070）

兰州百合（Lilium davidiivar.unicolor）是 百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）川百合的变种，为多年生鳞茎草本植物［1-3］，其鳞茎具有营养和滋补双重功效，是甘肃省的地方特色农产品，也是二阴山旱区农民的支柱产业。目前，兰州百合主要以无性繁殖为主，而长期的无性繁殖导致兰州百合病毒病日趋严重，种性退化，品质和产量下降等。解决这一问题目前最有效的方法就是繁育和推广脱毒种球［4-5］。采用组织培养技术，建立稳定的组培快繁体系，可有效提高种苗繁殖速度［6-7］，在获得大量幼苗的同时，还有利于保持亲本的优良性状［8］，是兰州百合进行品种改良的基础。在组织培养中，添加植物生长调节剂是比较普遍的现象。植物生长调节剂是植物组织培养的关键物质，尽管用量很少，但在植物组织培养中起着重要和关键的调节作用［9-11］。关于兰州百合组织培养方面的研究已有很多报道［8，12-14］，大多数试验采用正交设计不同浓度、不同激素的配比，以期归纳出最佳组合。然而正交设计只是不连续的点的优化组合，响应曲面法可以得到连续的函数关系，优化实验设计的优势明显。采用响应面法对培养基中添加物浓度进行合理配比［15］，明确各因素和响应值之间的关系，可获得更优、更简化的试验设计方法。

响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件并且能研究各因素间交互作用的数学统计方法，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系［16-18］。该方法实验次数少、周期短，求得的回归方程精度高［19-21］。Box-Behnken响应面法作为一种能快速优化工艺条件的方法已广泛用于各领域［22-26］，但通过响应面分析法优化兰州百合组培芽增殖的研究尚未见报道。我们在兰州百合组培快繁体系研究中，着重在百合芽增殖环节通过减少生长调节剂用量和种类，采用响应面优化法，以最经济、最有效的方式对试验参数进行分析和研究［27］，以期在提高增殖系数的同时简化培养基配方，为兰州百合提纯复壮及脱毒种苗种球产业化提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 外植体 选用外形饱满、颜色洁白、健壮无病斑的3年生兰州百合。将百合鳞茎剥去外层鳞片，取中内层鳞片，自来水冲洗干净，做好标记，用滤纸吸干水分后置3～5℃低温条件下预处理5～7 d，然后在超净工作台上用无菌水冲洗3～5遍。用75%乙醇消毒30～40 s，放入0.1%升汞溶液中消毒8～10 min，用无菌水冲洗5～6遍，置垫有无菌滤纸的培养皿中晾干备用。

1.1.2 试剂 所用植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopu-rine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）均购自Sigma公司，MS培养基所用试剂药品各成分均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 取经过消毒处理的兰州百合鳞茎的中内层鳞片于超净工作台上，切成0.3 cm×0.3 cm外植体接种到不定芽诱导培养基中。将鳞片上诱导长出的丛生芽，用解剖刀切取0.3 cm左右的单芽，接种到附加有不同浓度NAA、6-BA组合的芽增殖培养基（表1）中，每处理6瓶，每瓶接5株单芽，3次重复。增殖30～35 d后统计有效增殖芽数。

芽增殖系数=有效增殖芽数/接种芽数

1.2.2 响应面法优化试验 采用统计软件Design-expert11.0.4进行中心组合试验（Central Composite Design，CCD）设计。根据CCD中心组合试验设计原理，在前期单因素试验结果的基础上，选取中心组合试验因子和响应值进行响应面试验设计。每处理6瓶，每瓶接5株单芽，3次重复。定期观察统计增殖情况。

1.2.3 培养条件 于2017年3—8月在甘肃省农业科学院生物技术研究所实验室进行培养，基础培养基为含有3%蔗糖和0.5%琼脂的MS培养基，附加激素，pH为5.8～6.0。在2000～3000lx连续光照、温度（25±2）℃条件下培养，光照时间14 h/d，所用设备为植物组培常用仪器设备。

1.3 数据处理

单因素试验数据分析采用SPASS7.0软件进行，优化试验数据分析用Design-expert11.0.4。

2 结果与分析

2.1 单因素试验中不同植物生长调节剂浓度对兰州百合芽增殖的影响

从兰州百合试管苗芽增殖效果（表1）看，5号培养基（6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L）增殖系数达到最高，为3.47，与8号培养基（6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L） 增殖系数3.38差异不显著；其余处理对百合增殖的效果均较5号培养基降低，差异达显著水平（P＜0.01）。在添加有相同浓度NAA的培养基中，随着6-BA浓度的增加，芽平均增殖系数呈现一个先增后降的趋势，6-BA浓度为1.0、1.5 mg/L时，增殖系数较大，说明适量的植物生长调节剂配比能显著提高百合芽增殖系数。

2.2 响应面法优化试验

在单因素诱导试验中，6-BA和NAA配合使用对兰州百合芽增殖效果最好。根据CCD中心组合试验设计的原理，采用6-BA和NAA 2因素5水平的响应面法，以第5个配方浓度为中心参考值，通过实验设计所得各水平6-BA为0.19、0.50、1.25、2.00、2.31 mg/L；NAA 为 0.06、0.10、0.20、0.30、0.34 mg/L。

2.2.1 模型的建立及显著性检验 对6-BA浓度X1、NAA浓度X2做如下变换，xi=（Xi-X0）/X。式中，xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；X0为试验中心点处自变量的真实值；X为自变量的变化步长。共计13个试验点，1～8是析因试验，9～13是中心试验，零点试验重复5次，以估计试验误差。设计方案与试验结果见表2。所得数据经Design-expert11.0.4回归分析，以芽增殖系数（Y）为响应值，经回归拟合后，得最终的回归预测方程：

Y=-0.259 112＋4.577 90x1＋7.709 206 292 0 x2＋0.633 333x1x2-1.625 56x12－18.437 50x22

式中：Y为增殖系数；x1为6-BA浓度；x2为NAA浓度。从表3可以看出，回归方程的失拟检验差异不显著（P=0.338 3＞0.05），表明实验误差小并且方程式对实验拟合情况较好。总回归方程F检验P＜0.000 1，差异达到极显著。方程一次项的影响中，x1的P＜0.000 1，差异极显著；x2的P=0.124 6＞0.01，差异不显著；二次项x12的P＜0.000 1，差异极显著，x22的P=0.024 1＜0.05，差异显著；两因素间的交互作用x1x2的P=0.592 8＞0.05，差异不显著，校正决定系数R2=0.956 8，表明95.68%的试验数据可用此模型解释。由此看出，该回归方程对试验拟合情况较好，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。对试验结果及数据分析表明，6-BA（x1）对兰州百合芽增殖的影响最大，NAA（x2）影响不显著。

表1 不同激素浓度对兰州百合芽增殖的影响

表2 中心组合试验设计与结果

2.2.2 响应曲面分析 响应曲面和等高线图可以解释自变量之间的相互关系，还可以反映变量间的相互作用。响应曲面图形是特定的响应值y所对应的自变量构成的一个三维空间图，从响应面图中可看出最佳参数及各参数之间的相互作用关系。当特征值为正值时响应面分析图为山丘形曲面，可以得到极大值；当所有特征值为负值时，则为山谷曲面，有极小值存在；当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在［28］。而等高线形成的图形显示了两因素交互效应的强弱［27］。根据拟合方程，绘制出2个因素对兰州百合芽增殖系数的响应曲面（图1）和等高线（图2）。从图1可以看出，6-BA和NAA存在极点值，6-BA对百合芽增殖系数的影响较为显著，表现为曲线较陡；NAA对增殖系数的影响不显著，表现为曲线比较平缓。因此，培养基中6-BA的浓度变化对兰州百合芽增殖影响敏感，而NAA相对不敏感。由图2可以看出，6-BA、NAA两因素交互作用不显著。

表3 回归模型各项的方差分析

2.2.3 最佳配方验证 基于以上试验，回归模型预测的兰州百合芽增殖最佳培养基配方为6-BA浓度为1.25 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L。用所得最佳值进行响应面法所得结果的可靠性验证试验，每次10瓶，重复3次，统计有效芽增殖系数。实际得到的芽增殖系数为3.82，为理论预测值3.87的98.71%，与理论预测值基本吻合，证实了该模型的有效性。可见，采用中心组合试验设计（CCD）优化得到的兰州百合芽增殖培养基配方准确可靠，具有实用价值。

3 结论与讨论

研究结果表明，兰州百合有效芽增殖阶段细胞分裂素6-BA不可缺少，而生长素NAA和分裂素6-BA的组合比例不宜过高，太高会影响芽的增殖系数，只有二者优化组合，才能有效提高组培苗芽增殖系数。从前期单因素试验结果来看，在基础培养基MS中附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L的增殖效果较好，这与从响应面法优化出的兰州百合芽增殖最佳培养基为MS＋6-BA（1.25 mg/L）＋IBA（0.2 mg/L）基本一致，优化后的培养基增殖系数从之前单因素试验所得最高3.47提高到3.82。

兰州百合人工栽培条件下种球繁殖速度较慢，繁殖系数低，组织培养技术是繁殖种苗种球的有效手段之一。利用组织培养技术，可以在短时间内大批量的培育出所需要的植物新个体，还可以防止植物病毒的危害，极大的提高了农业生产效率。尤其是通过组织培养手段获得脱毒的原始材料以后，对进行百合种球的培育和生产具有重要的意义。关于兰州百合组培快繁技术的研究较多，同时添加的激素种类较多、激素浓度较高。龙春林等［29］的研究表明，兰州百合增殖培养以MS+NAA0.2 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L为宜，但其6-BA激素浓度较高，增加了成本，降低了产投比。另外，张红岩等［30］采用 MS+6-BA 1.5 mg/L＋2，4-D 1.0 mg/L＋GA3 0.8 mg/L培养基，尽管出芽较多，但激素种类偏多，所用6-BA浓度比本试验优化后的还高。本试验应用的响应面分析法与传统的数理统计方法相比，求得的各参数组合更加精确，同时用量更经济有效，可以大大降低生产过程中造成的原料浪费［25］。

本研究主要从基础培养基MS中添加最适宜浓度的6-BA和NAA2个因素入手，采用响应面法对兰州百合芽增殖培养基进行优化，以期提高兰州百合组培快速繁殖过程中增殖系数，同时筛选出最简化激素组合。在相同条件下，优化后的培养基尽可能地减少了添加植物生长调节剂的种类和降低了其用量，最终降低生产成本。