盛中伟，姬改革，刘一帆，巨晓军，单艳菊，邹剑敏，章 明，屠云洁，束婧婷

(江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125)

胸肌和腿肌是禽类主要的产肉部位。肌肉主要是由肌纤维组成，肌纤维的数量、直径、类型决定了肌肉的产量和品质。胰岛素样生长因子系统(insulin-like growth factors，IGFs)，由IGFs及其受体、结合蛋白等构成[1]。IGFs作为下丘脑-垂体-肌肉生长轴的关键组成部分，具有促进肌肉生长、加快动物生长发育等重要作用[2-3]。研究发现，胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors 1，IGF-1)能够提高肌纤维类型相关基因的转录和蛋白水平[4]。种蛋中注射IGF-1能够显著提高鸡胚胎期骨骼肌的质量和出雏后的饲料转化率[5]。IGF-1能够以自分泌和旁分泌的方式，通过与靶器官的受体(insulin-like growth factor I receptor，IGF1R)结合而发挥作用。IGF1R广泛表达于动物的肌肉[6]、皮肤[7]、大脑[8]、骨骼[9]等多个组织内。在鼠胚成纤维细胞中敲除IGF1R基因，细胞则停止生长[10]。Cheng等[11]报道，IGF1R基因的SNP位点与猪的早期的生长发育、屠体性状显著相关。鸡胚发育过程中，IGF1R基因的表达被阻断，则与肌肉生长发育相关的基因如Pax3、MyoD等的表达也被抑制[12]。综上所述，在鸡生长发育的早期阶段，IGF1R基因可能在骨骼肌肌肉生长发育方面扮演了重要角色。

本试验以自主培育的生长速度较快的花山麻鸡和生长速度较慢的清远麻鸡为素材，采用荧光定量PCR法研究不同品种鸡胚胎期和出雏后早期7日龄时胸肌和腿肌肌肉中IGF1R基因的表达变化情况，分析品种间、日龄间基因的差异表达及对肌肉生长发育的影响，以期为进一步研究IGF1R基因在鸡早期生长发育中的表达调控机制及合理利用地方品种资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

花山麻鸡是江苏省家禽科学研究所自主培育的配套系，清远麻鸡来自国家级清远麻鸡保种场。收集种蛋并孵化，在相同环境和饲养条件下进行饲养，全程自由采食和饮水。种蛋入孵后24 h为1胚龄，出雏当日记为0日龄，分别于9、12、16、21胚龄(E9 d、E12 d、E16 d、E21 d)和出雏后7日龄(7 d)，采集2个品种鸡的左侧胸肌和腿肌样品，称重后置于液氮速冻，然后转入-80 ℃冰箱保存。每个时间点采集12只，公母各6只。

1.2 主要试剂和仪器

TRNzol总RNA提取试剂、荧光定量预混试剂、FastKing cDNA第一链合成试剂盒购自TIANGEN公司；DNA Marker DL 2000为TaKaRa公司产品。9700 PCR仪和Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)；凝胶成像系统(Tanon 2500)；紫外分光光度计(Nano Drop One，Thermo)。

1.3 总RNA提取和cDNA合成

肌肉总RNA提取用Trizol法，按总RNA提取试剂说明书进行。RNA样品经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测合格后，取2 μg总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒使用说明书进行cDNA第一链合成，用内参基因GAPDH检测cDNA合成质量和是否有基因组DNA污染。产物保存在-20 ℃备用。

1.4 引物设计

根据GenBank中鸡的GAPDH基因(登录号：NM_204305.1)、IGF1R基因(登录号：NM_205032.1)序列设计引物，由上海英俊生物工程有限公司合成。引物信息如下：GAPDH-F：5′-CGATCTGAACTACATGGTTTAC-3′；GAPDH-R：5′-TCTGCCCATTTGATGTTGC-3′；片段大小为153 bp。IGF1R-F：5′-TTCAGGAACCAAAGGGCGA-3′；IGF1R-R：5′-TGTAATCTGGAGGGCGATACC-3′；片段大小为158 bp。

1.5 实时荧光定量PCR

荧光定量PCR参照试剂盒说明书推荐的反应体系进行引物浓度、退火温度等条件优化。20 μL的反应体系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O补足至20 μL。反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40个循环。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个平行。

1.6 统计分析

定量的结果采用2-ΔΔCt法进行处理，分析基因的相对表达量。ΔΔCt=ΔCt(其他日龄)-ΔCt(21胚龄)。采用SPSS 20.0统计分析软件进行分析，组间差异显著性用独立样本t检验，One-way ANOVA进行统计分析，采用Bivariate Correlation分析品种、日龄对胸肌和腿肌组织质量和基因表达的影响及其相关性。所有数据以mean±SE表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鸡发育早期胸肌质量和IGF1R基因表达的发育变化

如图1所示，花山麻鸡和清远麻鸡胸肌质量的变化趋势基本一致，均随着日龄增长逐渐增加。21胚龄时，两个品种的胸肌质量都降低，且显著低于16胚龄时的胸肌质量(P<0.05)，与12胚龄时的胸肌质量无显著差异(P>0.05)。21胚龄时，花山麻鸡的胸肌质量显著高于清远麻鸡(P<0.05)；7日龄时，花山麻鸡的胸肌质量极显著高于清远麻鸡(P<0.01)。

如图2所示，从胚胎期至出雏后早期7日龄，花山麻鸡胸肌IGF1RmRNA表达水平在9胚龄最高，之后显著降低并维持在较低水平，至7日龄时再次降低。清远麻鸡胸肌组织IGF1RmRNA表达水平出现2个波峰，分别在9胚龄和16胚龄。各胚(日)龄花山麻鸡胸肌组织IGF1RmRNA的表达量均显著低于清远麻鸡(P<0.05)。

图2 鸡发育早期胸肌IGF1R基因表达规律Fig.2 The profiles of IGF1R mRNA expression in pectoral muscles during early development in chickens

综上，鸡发育早期胸肌质量呈现极显著的日龄效应(F=825.79，P<0.01)和品种效应(F=114.57，P<0.01)；胸肌中IGF1R表达量呈现极显著的日龄效应(F=17.47，P<0.01)和品种效应(F=62.85，P<0.01)。

2.2 鸡发育早期腿肌重和IGF1R mRNA表达的发育变化

如图3所示，花山麻鸡和清远麻鸡发育早期腿肌质量的变化趋势基本一致，均呈现极显著的日龄效应(F=1 790.55，P<0.01)。12胚龄时，花山麻鸡的腿肌质量显著高于清远麻鸡(P<0.05)；21胚龄和7日龄时，花山麻鸡的腿肌质量极显著高于清远麻鸡(P<0.01)；鸡发育早期腿肌质量呈现极显著的品种效应(F=232.34，P<0.01)。

图3 鸡生长发育早期腿肌质量的变化Fig.3 The developmental changes of leg muscles weights during early development in chickens

如图4所示，花山麻鸡9胚龄和12胚龄的IGF1RmRNA表达量维持在高的水平，且两个时间点间无显著差异(P>0.05)；16胚龄开始显著降低，之后至7日龄，基因表达量维持在相对稳定的水平，16胚龄至出雏后7日龄，基因表达量在各个时间点之间无显著差异(P>0.05)。清远麻鸡9胚龄时IGF1R基因表达量最高，之后显著降低，基因表达量在各个时间点之间均出现显著差异(P<0.05)。清远麻鸡腿肌组织IGF1RmRNA的表达量均极显著高于花山麻鸡(P<0.01)。

图4 鸡发育早期腿肌IGF1R基因mRNA的表达规律Fig.4 The profiles of IGF1R mRNA expression in leg muscles during early development in chickens

综上，鸡发育早期腿肌重呈现极显著的日龄效应(F=1 790.55，P<0.01)和品种效应(F=232.34，P<0.01)；腿肌组织中IGF1RmRNA表达量呈现极显著的日龄效应(F=19.20，P<0.01)和品种效应(F=50.91，P<0.01)。

2.3 鸡发育早期肌肉质量和IGF1R mRNA表达变化的相关性

如表1所示，花山麻鸡在胚胎期至出雏后7日龄，胸肌IGF1RmRNA和胸肌质量、腿肌IGF1RmRNA和腿肌质量均呈极显著负相关(P<0.01)；清远麻鸡胸肌IGF1RmRNA和胸肌质量、腿肌IGF1RmRNA和腿肌质量呈极显著负相关(P<0.01)。

表1 鸡发育早期胸肌和腿肌IGF1R mRNA的表达与胸肌、腿肌质量的相关性分析

3 讨论

与其他物种相似，鸟类骨骼肌肌纤维数量在胚胎期已经确定，出雏后肌肉的生长主要是肌纤维的增长和直径的增加[13-14]。胚胎期是动物肌肉生长发育的第一个关键时期，出雏后早期则是肌纤维类型形成的重要时期[15]。因此，了解鸡胚胎期和出雏后早期IGF1RmRNA表达的变化趋势，有助于进一步研究肌肉生长发育的调控机制。

本试验分析了不同品种鸡胚胎期至出雏后7日龄时，鸡胸肌和腿肌质量和IGF1RmRNA表达变化规律。结果显示，在21胚龄时两个品种的胸肌质量都出现了显著降低。在鸭上也有相关报道，胚胎发育中后期，胸肌质量增长迟缓，出现萎缩的现象，推测可能是多个基因如FoxO1，IGF-1，MSTN基因等相互作用的结果[16-17]。腿肌质量则呈持续增长的趋势，说明在胚胎发育后期禽类胸肌、腿肌质量的增长并不同步。12胚龄时花山麻鸡腿肌质量显著高于清远麻鸡，胸肌质量在21胚龄时显著高于清远麻鸡。两个品种的腿肌质量出现显著差异的时间点早于胸肌质量出现显著差异的时间点，推测IGF1R基因对不同类型肌肉组织调控的强度不同。清远麻鸡胸肌和腿肌中IGF1RmRNA表达量均显著高于花山麻鸡。快速生长型花山麻鸡肌肉质量在胚胎期已经高于清远麻鸡，提示在生长发育早期，遗传背景差异会导致肌肉质量在胚胎期就已经出现显著差异。综上，两个品种的胸肌和腿肌IGF1R表达量在出雏后都出现了不同程度的下降，清远麻鸡下降的程度更高。在猪上的研究发现[18]，2月龄之后，猪背最长肌组织中IGF1RmRNA表达量随着日龄的增加而逐渐降低。相关性分析进一步证实IGF1RmRNA在胸肌和腿肌中的表达量与肌肉质量呈显著相关，这与鸭胸肌和腿肌中IGF1RmRNA表达量与肌肉质量呈显著相关的结果基本一致[19]，推测IGF1R基因可能在鸡胚骨骼肌生长发育过程中具有重要的作用。

鸡发育早期胸肌和腿肌组织中IGF1RmRNA表达量的变化规律在品种间存在明显差异。在鸡胚早期肌肉发育过程中，IGF-1基因的表达能够促进鸡胚成肌细胞的增殖和肌纤维的形成[20]。研究认为，鸡胚胎期血液中IGF-1主要来源于肝外组织[21]，鸡胚胎期骨骼肌中IGF-1基因的表达在肌肉生长发育中具有重要作用[22]。IGF1R作为IGF-1的受体，在骨骼肌早期发育中的高表达，说明其可能参与了鸡早期胸肌和腿肌肌纤维形成和发育的调控。已有研究表明，IGF1R基因在不同物种不同类型肌肉中的表达量变化模式存在一定的差异，同一物种不同品种同一类型肌肉组织中的表达量变化模式存在差异[18，23-24]。提示，遗传背景的差异可能导致鸡胚早期骨骼肌重的差异生长和IGF1R基因的差异表达。