刘发煇 侯婉云 朱丽兰 罗春英

【摘要】目的探究CDGSH铁硫结构域2（CISD2）在肝细胞癌（HCC）发生发展中的作用、临床病理意义及其潜在作用机制。

方法Kaplan Meierplotter分析CISD2 mRNA表达与HCC患者5年生存率的关系;在线网页工具STRING构建CISD2蛋白相互作用网络，基因本体论富集分析CISD2蛋白质功能;网页工具TIMER分析CISD2在HCC中与免疫细胞浸润含量之间的关系;GSEA分析CISD2高表达在HCC中参与的信号通路。

结果（1）CISD2 mRNA高表达的HCC患者的5年总生存率低于低表达患者;（2）CISD2与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润呈负相关;（3）CISD2主要参与了细胞内二价铁硫簇结合，铁硫簇绑定以及金属集群绑定;（4）GSEA分析表明CISD2高表达在HCC中促进卟啉和叶绿素代谢，戊糖、葡萄糖醛酸转换，抗坏血酸和醛酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢等多条代谢通路。

结论（1）在HCC中，CISD2 mRNA高表达与HCC患者的较差预后有关。（2）CISD2可能通过影响肿瘤细胞的铁离子、能量代谢和肿瘤免疫微环境促进肿瘤细胞的生存和增殖。

【关键词】CISD2 ;肝细胞癌;生物信息学;预后;功能网络分析

中圖分类号：R735.7文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.06.003

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role，clinicopathological significance and potential mechanism of CDGSH Iron Sulfur Domain 2（CISD2） in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma（HCC）.

MethodsKaplanMeierplotter was used to analyze relationship between CISD2 mRNA expression and 5year survival rate of HCC patients.Online web tool STRING was used to build CISD2 protein interaction network，gene ontology enrichment was used to analyze CISD2 protein function.In addition，Web TIMER was used  to analyze relationship between CISD2 and the infiltration of immune cells in HCC，and GSEA was used to analyze the signaling pathways involved in the high expression of CISD2 in HCC.

Results（1） 5year overall survival rate of HCC patients with high CISD2 mRNA expression was lower than that of patients with low CISD2 mRNA expression.（2） CISD2 was negatively correlated with the infiltration of B cells，CD4+T cells，CD8+T cells，macrophages，and dendritic cells.（3） CISD2 mainly involved in the bindings of the ironsulfur group，ironsulfur cluster，and metal cluster.（4） GSEA analysis showed that CISD2 high expression promoted porphyrin and chlorophyll metabolism，pentose and glucuronic acid conversion，ascorbic acid and aldehyde acid metabolism，amino and nucleotide glucose metabolism，and starch and sucrose metabolism in HCC.

Conclusion（1） In HCC，high CISD2 mRNA expression is associated with poor prognosis in HCC patients.（2） CISD2 may promote the survival and proliferation of tumor cells by affecting the iron ion，energy metabolism and tumor immune microenvironment of tumor cells.

【Key words】CISD2;HCC;bioinformatics;prognosis;functional network analysis

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在与癌症相关的死亡原因中，HCC是死亡率第三的肿瘤[1]。但其潜伏期长，多数患者在肝癌晚期才出现症状，由于肝癌的高复发率和高转移率，晚期肝癌患者的5年生存率不超过5%。因此，如何在早期对HCC进行准确判断和检测对HCC治疗具有积极的意义。在过去的20年中，大量的分子标志物被发现在HCC患者中异常表达，它们都具有潜在的临床应用价值。然而，HCC的发病机制复杂，涉及细胞周期调节和信号转导等过程，反映细胞的功能以及多个基因在多个步骤中的相互作用，通过筛选与肿瘤形成和进展相关的基因网络，有可能发现新的HCC药物靶点。

CDGSH铁硫结构域2（CDGSH Iron Sulfur Domain 2，CISD2）是细胞内保护线粒体结构完整以及维持能量代谢功能的关键蛋白，由CISD2基因编码，主要位于线粒体的外膜上[2]。尽管许多实验已经表明CISD2在多种肿瘤中存在表达异常，但目前CISD2在HCC中表达及其具体作用仍存在争议：在非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎中，通过上调CISD2的表达，可特异性地增强Serca2b活性和细胞内氧化应激，帮助维持代谢平衡和逆转脂肪变性，从而阻止其向HCC的发展[3];而CHEN等人[4]的实验表明CISD2在HCC肿瘤组织中高表达并且上调CISD2的表达可促进肝癌细胞的增殖和致瘤性。以上两种研究表明目前CISD2在HCC中的作用尚不完全清楚，因此本课题利用生物信息学分析从多方面、不同层次探讨了CISD2在HCC发病过程中的交互作用以及相关机制。

1材料与方法

1.1KaplanMeier Plotter分析CISD2 mRNA表达与患者预后相关性

KaplanMeier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）[5]是一款在线预后分析网站，提供HCC的mRNA和miRNA的表达与生存相关性的分析。本实验利用KaplanMeier Plotter分析了从GEO、EGA和肿瘤基因组图谱（TCGA）获得的芯片数据以及RNAseq数据中一共364例HCC患者CISD2 mRNA的表达情况与HCC患者预后的关系。在KaplanMeier Plotter数据分析平台中，先检索CISD2基因，然后应用该平台的在线分析软件绘制CISD2高低表达的生存曲线。限定条件为总体生存率（OS），生存时间统计最长为60个月。肿瘤病理类型、分期及其病人性别等其他条件不做限制，从而评估CISD2 mRNA表达与HCC患者5年总生存率的关系，结果以P<0.05为有统计学意义。

1.2TIMER分析CISD2 mRNA表达与免疫浸润含量之间的相关性

TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）[6～7]是用于系统分析各种癌症类型的免疫细胞浸润情况的综合资源。TIMER数据库包括来自TCGA的32种癌症类型10 897个样本。本实验分析了来自TCGA的374例HCC患者CISD2 mRNA表达量与六种免疫细胞（B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）含量的相关性，在TIMER数据分析平台中，通过在“Gene”模块中输入CISD2基因以及选择肿瘤类型“LIHC”（肝细胞性肝癌）即可通过TIMER评估CISD2 mRNA表达与HCC患者免疫细胞浸润情况的关系，结果以P<0.05为有统计学意义。

1.3CISD2蛋白质相互作用网络的构建及GO富集分析

蛋白质功能的完整描述需要了解与之特异性结合的所有伴侣蛋白质。STRING[8]（https：//stringdb.org/）通过为大量生物体提供全面但质量受控的蛋白質蛋白质结合体来简化对这些信息的访问。该工具关联了来自高通量实验，数据库，文献的挖掘以及基于基因组环境分析预测的数据。使用STRING 11.0数据库收集包含5090个物种中的24 584 628种蛋白之间的相互作用信息，找到“Protein by name”模块，输入CISD2基因，选择物种“Homo sapiens”，并设置最低相互作用分值为0.4后即可获得CISD2蛋白相互作用网络。GO富集也被称为基因本体（Gene Ontology）富集，它涵盖了生物学的三个方面：细胞组分（cellular component）、分子功能（Molecular Function）、生物过程（biological process）。我们采用R软件扩展包“cluster profiler”[9]对CISD2蛋白相互作用网络中的基因进行GO富集分析，以P<0.05为有统计学意义，并用R语言“GO plot”包[10]进行了结果可视化，从而探究CISD2蛋白质功能。

1.4GSEA分析CISD2在HCC中参与的信号通路

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[11]是用来评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，判断其对表型的贡献。通过软件GSEA_4.0.3（https：//www.gseamsigdb.org/gsea/index.jsp）进行分析，该软件的输入数据包含两部分，一个是基因表达矩阵文件，另一个是CISD2基因根据表达值的中位数将肿瘤组织样本分为高表达组和低表达组文件，GSEA软件会对基因根据其和表型的相关度从大到小排序，然后判断基因集内每条注释下的基因是否富集于表型相关度排序后基因表的上部或下部，从而判断此基因集内基因的协同变化对表型变化的影响。TCGA计划是由美国于2006年联合启动的项目，它以大规模测序为主的基因组分析技术为基础，旨在使用基因组测序和生物信息学来分析癌症相关的基因突变。迄今为止，TCGA已对来源于11 000位患者的33种肿瘤进行实验，其中包括10种罕见肿瘤，数据量达2500T。在本实验中，我们选用从TCGA下载的374例HCC患者基因表达矩阵作为预先定义的基因集，并提取其中CISD2的表达值进行高低分组，利用GSEA软件分析CISD2表达水平对各种生物通路基因集的作用，按照GSEA软件默认参数，随机组合1000次进行富集分析。按总体错误率（family wise error rate，FWER）进行排序，并将FWER<0.05的基因集作为显著富集基因集。

1.5统计学方法

所有的数据分析均采用网页以及软件自带的数据分析功能进行统计学分析，检验水准为α=0.05。

2结果

2.1生物信息学分析CISD2与HCC患者的预后相关性结果

生物信息学分析表明，CISD2的mRNA表达水平与HCC患者的总体5年生存率相关（P=0.041）。见图1。其中CISD2 mRNA高表达患者的5年中位生存时间为36个月，CISD2 mRNA低表达患者的5年中位生存时间为45个月，研究结果表明CISD2 mRNA高表达提示HCC患者预后较差。

2.2CISD2与免疫浸润含量分析

肿瘤免疫微环境由肿瘤细胞、间质细胞和浸润免疫细胞组成。我们利用TIMER初步探究了CISD2表达与免疫细胞浸润的潜在联系。结果表明，CISD2与B细胞（P=5.44E04）、CD4+T细胞（P=3.94E06）、CD8+T细胞（P=2.90E03）、巨噬细胞（P=9.22E07）和树突状细胞（P=3.19E04）的浸润有关联，且都呈负相关。见图2。

2.3生物信息学分析CISD2的PPI互作网络及GO富集结果

网页工具STRING进行PPI分析，发现SFXN4、COX4I1、WFS1、GIMAP5、TSFM、MRFAP1、CISD3、MTPAP、OPA3、SOD1 共10个基因与CISD2相互作用最为密切，结果如图3所示。随后，本实验使用R语言包“cluster profiler”对这11个蛋白进行了GO富集分析，并用R语言“GO plot”包进行了结果可视化。GO富集分析结果显示CISD2在分子功能（Molecular Function）方面主要参与了2价铁硫簇结合（P=0.003）、铁硫簇绑定（P=0.007）以及金属集群绑定（P=0.007）。见图4。

2.4GSEA结果分析

利用GSEA分析CISD2高表达促进的信号通路，分析结果表明，CISD2高表达在HCC中促进卟啉和叶绿素代谢（P=0.002），戊糖、葡萄糖醛酸转换（P=0.005），抗坏血酸和醛酸代谢（P=0.011），氨基糖和核苷酸糖代谢（P=0.022），淀粉和蔗糖代谢（P=0.023）这些信号通路，表明CISD2在HCC中可能通过调节细胞的代谢过程促进肿瘤的发生发展。见表1。

3讨论

HCC是世界许多地区癌症相关死亡的主要原因。过去的几十年里，在了解肝细胞癌的流行病学、危险因素和分子特征方面取得了相当大的研究进展，但HCC的具体分子机制尚不清楚，仍有待进一步探究。目前已有研究证明CISD2在肝癌中表达异常，但其具体分子作用尚未被完全阐明，因此在本实验中，我们通过生物信息学手段确定了CISD2 mRNA的高表达与HCC患者较差的5年生存率相关，接着为了探究其潜在机制，评估了CISD2 mRNA与HCC患者免疫细胞的浸润情况。然后通过构建CISD2蛋白质相互作用网络并且使用GO富集分析，从而了解CISD2蛋白的功能，并通过GSEA富集分析了CISD2在HCC中促进的通路。

为了探究CISD2在细胞中的功能，本课题借助生物信息学的基因本体论分析，探究了CISD2的分子功能。结果表明CISD2主要参与了2价铁硫簇结合，铁硫簇绑定。过去10年间，科研人员发现“铁依赖”成为癌细胞的一种关键表型。尽管这种“铁依赖”的确切原因在很大程度上是未知的[12～13]，但有人提出，癌细胞需要过量的铁来支持它们的高代谢率，因為铁是许多不同蛋白质的辅因子，包括参与DNA和蛋白质合成、糖酵解和呼吸等过程[14]。因此，针对癌细胞对“铁依赖”的治疗方法已经被提出[15]。癌细胞表现出的铁和活性氧依赖的表型，结合CISD2蛋白对线粒体铁和活性氧的调控作用以及不同肿瘤中CISD2蛋白的高表达水平，也提示CISD2蛋白可能在支持癌细胞增殖中发挥关键作用。事实上，如上所述，许多研究报告了CISD2蛋白过表达与癌细胞增殖、肿瘤生长和转移之间的直接联系。虽然从这些研究中可以明显看出CISD2蛋白在促进肿瘤方面的作用，但目前仍缺乏CISD2蛋白在肿瘤细胞增殖中作用机制的研究。针对CISD2对肿瘤细胞内铁调控的研究将会对CISD2蛋白在癌症增殖中作用机制有进一步的了解。

修复抗肿瘤免疫缺陷一直是癌症治疗中的难题，近年来，免疫疗法已逐渐成为治疗肿瘤的最有前景的方法。目前观点普遍认为免疫浸润与肿瘤的发生发展有着密不可分的关系。为了初步探究CISD2的表达与HCC中免疫浸润的关系，我们利用生物信息学的方法对CISD2 mRNA表达水平与不同的免疫细胞浸润含量进行了表达相关性分析，研究结果表明，CISD2 mRNA表达与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润含量呈负相关，故推测高表达CISD2通过某种机制降低肿瘤中免疫细胞的含量，增加了肝癌细胞的免疫逃逸，从而促进了肿瘤的增殖，提示今后靶向CISD2的免疫治疗策略成为可能，但免疫细胞间的具体相关性，例如CISD2与CD4+T细胞之间的相关性是不是因为CD8+T细胞的影响而产生的，这些都有必要后续进一步的实验进行验证。尽管如此，本研究结果依然表明研究CISD2在HCC中与免疫细胞的关系，将会有助于今后免疫疗法在HCC中的治疗。最后，本课题还通过GSEA富集分析，探究了高表达的CISD2在HCC中所促进的通路。结果显示CISD2高表达促进肿瘤细胞的代谢功能，包括卟啉和叶绿素代谢，戊糖、葡萄糖醛酸转换，抗坏血酸和醛酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢。卟啉主要在人体肝脏内进行合成与利用，同时肝脏也是卟啉代谢异常时病变的好发部位，张璎等人[16]的研究表明，卟啉峰值异常升高在原发性肝癌中表现明显，同时将甲胎蛋白与卟啉峰值进行联合应用能有效提高临床原发性肝癌的诊断效果;叶绿素作为一种广泛存在的自然产物，与其衍生物在肿瘤治疗中表现出良好的调节作用，它们作为化疗辅助剂或是对肝癌的有效预防在实验中都得以证明[17]。戊糖、葡萄糖醛酸转换为肿瘤细胞代谢提供所必需的维生素C，而抗坏血酸和醛酸代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢都影响了体内正常的糖代谢，这些结果都表明了CISD2可能通过影响肿瘤糖代谢表现出与肿瘤细胞增殖生长相关的特性。石汉平[18]的研究认为肿瘤是一种代谢性疾病，调整肿瘤的治疗策略与方向，将肿瘤营养与代谢调节治疗作为肿瘤研究与治疗的新方向，将更有利于肿瘤的治疗，因此了解CISD2在HCC中的代谢调节通路也有助于将来在肿瘤中的代谢治疗提供一定的参考价值。

综上所述，我们通过多种生物信息学分析方法，先确定了CISD2 mRNA的高表达与HCC患者较差的预后相关，随后初步探究了CISD2表达与肿瘤患者免疫细胞浸润含量的相关性，CISD2蛋白的分子功能以及CISD2在HCC中所参与的信号通路。进一步阐明了CISD2在HCC中的临床意义以及为后续的研究提供了一定的理论基础。

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（收稿日期：2020-04-08修回日期：2020-05-15）

（编辑：王琳葵梁明佩）