李玟君姚娟娟邓爱华杨胜平裘雨萱李 玮

(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北 武汉 430068)

姜黄素是一种生物性很强的天然二酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性[1-2]。但是在应用中存在着溶解度不高、稳定性差等问题导致了其生物利用度较低。花生蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒无害,且与动物性蛋白相比,不存在受病毒污染等安全性问题[3-7],具有优良的纳米成粒性,是很好的制备纳米颗粒的材料[6,8-9]。然而,花生蛋白的结构为紧密的四级结构,无活性基团暴露,需要进行分子修饰使蛋白分子展开来提高蛋白的凝胶性。

本实验利用超声波辅助热碱对提取的花生分离蛋白进行改性,研究超声波功率、碱液的pH、加热温度和处理时间等条件对花生蛋白分子结构、姜黄素包埋率的影响,并利用响应面分析法对花生蛋白的改性条件进行优化,为姜黄素和花生蛋白的高效利用提供新的思路。

1 试验方法

1.1 花生分离蛋白的制备

参考马铁铮[7]的方法,略有改动。花生仁干燥后脱红衣,粉碎过60目筛后,加入5倍质量体积的石油醚脱脂,浸提2h,4℃,6000r/min离心5min,重复浸提脱脂三次后离心所得固体残渣按照质量比为1∶5的量加10%的NaOH调浆,调节pH=9,搅拌后6000r/min离心5min收集滤液,用8% HCl调节滤液pH=4后静置1 h,收集沉淀,将沉淀用去离子水洗涤至中性后冻藏,用真空冷冻干燥机干燥72 h所得样品备用。

1.2 不同修饰条件的花生分离蛋白的制备(单因素实验)

考察不同修饰条件对花生分离蛋白包埋姜黄素的效果。称取10g花生分离蛋白溶解于100mL碱液中,控制超声波功率和水浴温度对花生分离蛋白进行改性修饰,控制碱液pH分别为7、8、9、10、11、12、13,超声波功率为0、50、100、150、200、250、300W,温度为70、75、80、85、90、95、100℃,加热时间为10min,上述操作完成后静置冷却至室温后6000r/min离心5min收集滤液,用8% HCl调节滤液pH=4后静置1 h,收集沉淀,将沉淀用去离子水洗涤至中性后冻藏,用真空冷冻干燥机干燥72 h后收集样品,即得不同修饰条件制备的修饰花生蛋白。称取6g修饰后的花生蛋白溶于100mL双蒸水中配制成修饰花生蛋白溶液备用。

1.3 修饰蛋白总巯基含量和二硫键含量的测定

总巯基含量的测定参考Beveridge等改进的Ellman 试剂法[12]。总巯基的测定主要参考Hu等的方法[13]。

1.4 花生蛋白包埋姜黄素颗粒的制备

称取0.5g姜黄素溶于1L无水乙醇中配制质量浓度为0.05%姜黄素乙醇溶液,取30 mL姜黄素乙醇溶液与50mL的1.3.2中各种修饰条件制备的花生蛋白溶液混匀后,避光搅拌反应2h。再向混合溶液中加入5mmol/L的CaCl280mL,室温下静置16 h后使用14000D的透析袋进行脱盐处理72 h,冷冻干燥后即得包埋姜黄素的固体花生蛋白颗粒。

1.5 包埋率的测定

参考Laura G的方法,用高效液相色谱测定[14]。

1.6 响应面试验

根据 Box-Benhnken中心组合试验设计原理,依据上述单因素试验结果,选取碱液pH(P),加热温度(T),超声波功率(Q)和反应时间(S)四个因素,以姜黄素包埋率(d)为指标,设计四因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验。

1.7 数据处理

数据用OriginPro 2007 (OriginLab Corporation, USA)和 SAS 8.1 (North Carolina State University, US)处理,测量结果平均值±偏差(±std)表示,显著性水平为0.05和0.01,不同字母表示同列数据间的差异程度(p＜0.05)。

2 结果与讨论

2.1 修饰条件对花生分离蛋白游离巯基和二硫键含量的影响

2.1.1 碱液pH对花生分离蛋白分子结构的影响

由图1可得到,在7≤pH≤11的范围内,随着碱液pH值的升高,花生分离蛋白游离巯基的含量从10.35±0.63μmol/g(pH=7)逐渐增大至时18.26±0.93μmol/g (pH=10)并保持不变;二硫键的含量从44.62±0.48μmol/g(pH=7)减小至34.26±2.03μmol/g(pH=11)并保持不变,说明当pH值超过11时,极端pH条件下可能会导致花生分离蛋白发生变性。研究发现蛋白质在碱性环境中,主链肽键断裂导致一级结构的变化,二级结构也可能发生重大变化[19],强碱处理高浓度蛋白时,蛋白质的理化特性会发生较大变化,巯基与二硫键之间发生交换反应[15]或者β-消除反应等[16-17]。本实验中二硫键的含量与游离巯基含量的变化也证明了在碱性条件下花生分离蛋白分子基团发生解离。

2.1.2 温度对花生分离蛋白分子结构的影响

图1 碱液pH对花生分离蛋白分子游离巯基和二硫键含量的影响Fig.1 Effect of pH on the content of free thiol and disulfide

图2 加热温度对花生分离蛋白分子游离巯基和二硫键含量的影响Fig.2 Effect of heating temperature on the content of free thiol and disulfide

由图2可得到,在温度为70℃≤T≤90℃的范围内,随温度的升高,花生分离蛋白游离巯基的含量从10.35±0.94μmol/g(T=70℃)逐渐增大至19.67±0.68μmol/g(T=90℃)时温度继续升高,游离巯基的含量会逐渐下降至17.86±0.22 μmol/g(T=100℃);而二硫键的含量从45.02±2.84μmol/g(T=70℃)降低至34.26±2.03 μmol/g(T=90℃)。研究发现热处理蛋白可以预先使蛋白质的部分去折叠,降低了蛋白质在界面上发生结构展开的能垒,热处理蛋白具有较高的游离巯基,且内卷于蛋白聚集体内部,当蛋白吸附于油水界面后,聚集体结构展开重排,利于游离巯基在界面上的氧化或与其他游离巯基接触,即可形成二硫键,进而提高了蛋白的膨胀模量[21-23,25]。本研究中游离巯基随着加热温度升高而降低,二硫键含量却呈现随温度升高而降低的趋势,有可能是加热使得花生分离蛋白发生聚集,游离巯基内卷,抑制了二硫键的形成。

图3 超声波功率对花生分离蛋白分子游离巯基和二硫键含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of free thiol and disulfide

2.1.3 超声波功率对花生分离蛋白分子结构的影响

由图3可得到,在超声波功率Q≤300W的范围内,随功率升高,花生分离蛋白游离巯基的含量从12.44±0.73μmol/g逐渐增大至19.46±0.24μmol/g(Q=250W);二硫键的含量从42.29±1.24μmol/g减小至33.28±0.64μmol/g (Q=300W)。研究表明, 超声波处理可以在蛋白质溶液中产生局部的极端温度和压力,可以诱导蛋白质的高级结构发生变化,从而有利于蛋白质在油水界面形成吸附层,蛋白质在这种条件下容易发生去折叠化,从而暴露出更多的活性基团[26-27]。

2.2 修饰条件对姜黄素包埋率的影响

图4(a)可看到,加热温度在80～100℃的范围内,随着加热温度的增大,姜黄素的包埋率呈先增大后减小的趋势,当加热温度为90 ℃时,包埋率达到最大,为64.52±1.08%。因此选定加热温度为85、90、95℃作为作为包埋试验的优水平进行响应面设计。

图4(b)可看到,碱液pH值在9～13范围内,随着pH值的增加,姜黄素的包埋率呈先增大后减小的趋势,当pH为10时,包埋率达到最大,为75.68±1.64%,因此选定pH值为9、10、11作为包埋试验的优水平进行响应面设计。

图4(c)可看到,超声波功率在100～300W的范围内,随着功率的增加,姜黄素的包埋率呈先增大后减小的趋势,当功率为200W时,包埋率达最大,为76.25±2.64%,因此选定功率为150、200、250W作为包埋试验的优水平进行响应面设计。

图4(d)可看到,加热时间在5～25 min的范围内,随加热时间延长,姜黄素的包埋率呈先增大后不变的趋势,当加热时间为15min或20min时,包埋率达最大,因此选定加热时间为15、20、25 min作为包埋试验的优水平进行响应面设计。

图4 蛋白修饰条件对姜黄素包埋率的影响Fig.4 Effects of protein modification conditions on the embedding rate of curcumin

2.3 响应面试验优化姜黄素包埋工艺

试验因素与水平设计见表1。

利用SAS 8.1软件对表2的试验数据进行多元回归拟合,得到姜黄素包埋率对碱液pH(P),加热温度(T),超声波功率(Q)和加热时间(S)的回归模型:

d=-2968.59+42.18T+11.24S+151P+2.13Q-0.22T×T+0.127S×T-0.242S×S-0.285P×T-1.188P×S-5.12P×P-0.001Q×T-0.003Q×S+0.004P×Q-0.003Q×Q(R2=0.9306)

表1 试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 响应面试验结果Table 2 Result of response surface analysis method

对该回归方程进行显著性检验,并由统计学相关软件进行分析得表3,可知p＜0.0001,说明该数据模型达到极显著水平,R2=0.9306表明模型的拟合度好,说明响应值的改变有93.06%与自变量的改变有关。失拟度p=0.4803＞0.05,不显著,表明回归方程与实验值拟合较好,试验误差小。根据F值大小可得出各因素对提取率的影响顺序依次为:pH、温度、时间、超声功率。

图5 pH与加热时间的交互作用对姜黄素包埋率影响的等高线及响应曲面Fig.5 Contour and response surface of the interaction between heating temperature and pH on the loading rate of curcumin

图6 加热温度与时间的交互作用对姜黄素包埋率影响的等高线及响应曲面Fig.6 Contour and response surface of the interaction between heating temperature and heating time on the loading rate of curcumin

由图5响应面及等高线数据分析可知:碱液pH与加热时间S交互作用对姜黄素包埋率有极显著性影响;反应时间S与加热温度T交互作用对姜黄素包埋率影响较显著(图6)。

2.4 最佳工艺条件的确定及验证

由响应面可知,模型存在稳定点,且稳定点是最大值。通过响应面法得到姜黄素包埋最优工艺理论条件:碱液pH值(P)为9.8,加热温度(T)为90.45℃,超声波功率(Q)为228.08W,加热时间(S)为20.74 min;此条件下姜黄素包埋率为83.44%。考虑实际操作的可行性,取pH=9.8,加热温度T=90℃,超声波功率Q=225W,加热时间S=21min,按此条件实验重复三次得到的姜黄包埋率83.27±1.06%。与卵白蛋白[28]、芸豆异源蛋白[29]为壁材制备的姜黄素纳米颗粒相比工艺更简单,载荷更高。

3 结 论

实验研究了超声波辅助热碱修饰对花生蛋白分子结构的影响和利用该修饰蛋白包埋姜黄素制备纳米颗粒的工艺条件。研究发现在碱性范围内,随着碱液pH值的升高,花生分离蛋白游离巯基的含量逐渐增大,二硫键的含量逐渐减小;在超声波功率为Q≤300W的范围内,随着功率的升高,花生分离蛋白游离巯基的含量逐渐增大,二硫键的含量逐渐减小;随着温度的升高,花生分离蛋白游离巯基的含量逐渐增大(70℃≤T≤90℃),温度继续升高,游离巯基的含量会逐渐下降至17.86±0.22μmol/g(T=100℃),而二硫键的含量逐渐降低(70℃≤T≤90℃)。

在单因素试验的基础上,根据 Box-Benhnken设计响应面试验,建立姜黄素包埋率的二次多项式回归模型,并应用响应面分析法对利用花生蛋白包埋姜黄素重要因素进行优化。研究结果显示,超声波辅助修饰花生蛋白包埋姜黄素最优工艺参数为pH=9.8,加热温度T=90℃,超声波功率Q=225W,加热时间S=21min,该条件下姜黄素包埋率达到83.27±1.06%。利用响应面法优化超声波辅助花生蛋白包埋姜黄素的工艺条件,可为扩大姜黄素的应用范围,促进花生加工业的技术进步提供技术支持。