荣 恒，李 晶，柳 楠，张梦瑶，贺建宁*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.曲阜市畜牧兽医技术服务中心，山东济宁 273100）

随着人们生活水平的提高，人们对羊毛的需求量不断增加，对羊毛产量、质量的研究显得尤为重要[1]。羊毛是毛囊的衍生物，羊毛产量和质量取决于毛囊的性质和结构[2]。与要控制羊毛的性状发育特征，更取决于对毛囊发育规律和结构特征的研究[3]。敖汉细毛羊作为我国极具代表性的细毛羊品种之一[4]，大多数关于敖汉细毛羊羊毛的研究都集中在分子水平上探究羊毛性状形成的机理[5]和羊毛的生长部位[6]，而在细胞水平上探索毛囊生长相关的基因也非常重要。

Chordin在腹原轴形成和原肠胚形成期间诱导神经组织，也在维持和分化中起主要作用[7]。据报道，Chordin是细胞外BMP 拮抗剂，以其高亲和力与BMP-2/4 结合，进一步干扰与BMP 受体的结合[8]。Chordin作为BMPs 的分泌拮抗剂，在细胞外空间中对BMPs 的功能进行调节。Chordin基因与BMP 基因家族结合并阻止Chordin与其受体相互作用进而影响BMPs 的表达传递[9]。BMPs 作为毛囊发育的抑制信号分子[10]，Chordin可阻止其传导途径，间接体现出对毛囊发育的促进作用。

目前，关于Chordin和BMP6基因对细毛羊毛囊的影响基本明确，但只是基于分子层面，且Chordin和BMP6基因的相互作用尚未清晰。因此，本实验通过将Chordin、BMP6质粒共转染成纤维细胞后在细胞水平上验证两基因间的相互作用，为进一步的分子育种工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取40 日龄的健康胎羊（由青岛奥特种羊场提供）并及时消毒处理。

TRIZol（Roche）试剂、蛋白裂解液、EcoRI 限制性内切酶、KpnI 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、pcDNA3.1 质粒、DH5α感受态细胞、DMEM（基础培养基）、胰蛋白酶、标准胎牛血清、DPBS（磷酸缓冲盐溶液）、Lipofectamine 2 000、反转录试剂盒、SoSo试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、培养皿等均购自青岛尚赛科贸有限公司[11]。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 从组织中提取RNA 并反转录成cDNA。在绵羊Chordin和BMP6基因序列（GenBank登录号分别为XM-027957560.1 和XM_027958445.1）CDS 区外侧通过Primer5.0 设计引物，并在上游引物和下游引物的5'加入同源臂。Chordin基因完成后的引物序列上游引物：5'-TTTAAACTTAAGCTCGGAATTC CCCCAGCTGTCCCGTTCG-3'；下游引物：5'-TGGATC CGAGCTCGGCTAGGAGCCTTCATCTTCTTTCCCAG AC-3'。BMP6基因完成后的引物序列上游引物：5'-TT TAAACTTAAGCTTGGTACCATGATTCCTGGTAACC GAATGCTG-3'；下游引物：5'-TGGATCCGAGCTCGG TACCTCAGCGGCACCCACATCCCTCCACTA-3′。

通过PCR 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，体系均为25 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，金牌Mix 22 μL。

1.2.2Chordin、BMP6基因与pcDNA3.1 质粒同源重组对pcDNA3.1 质粒进行EcoRI、KpnI 单酶切，酶切体系：EcoRI 1 μL，KpnI 1 μL；pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，补水至50 μL；置于37℃金属浴中2 h。电泳检测后，通过切胶回收试剂盒纯化Chordin、BMP6基因及切开的pcDNA3.1，通过T4DNA 连接酶将Chordin、BMP6基因与pcDNA3.1 分别进行连接，体系：Chordin、BMP6基因各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL；置于50℃金属浴10 min。之后转至DH5α感受态细胞，选取摇菌后的单菌落对其进行阳性率测定，经测序、质粒提取最终获得阳性质粒[11]。

1.2.3 成纤维细胞的培养 用75%酒精浸洗2 遍从羊场取回的40 日龄胎羊成之后，在培养皿中用75%酒精再次清洗3 遍，最后用含有双抗的PBS 反复清洗3 遍。之后用剪刀剪掉头部和四肢，然后将躯干剪成1.5 mm3左右，将其放在培养皿，加胎牛血清，在细胞培养箱CO2为5%、温度37℃的培养箱中培养4 h，再加培养液。从培养箱拿出24 h 后，用PBS 冲洗干净，更换培养液，定时观察。细胞生长到95%左右进行传代培养[11]。

1.2.4 细胞转染 在传代后2 代进行转染。用Lipofecta mine 2 000 进行瞬时转染，单、共转染组分别加20 μL脂质体试剂和480 μL DMEM（不含双抗），混匀，静置10 min。在共转染组中加入20 μL 构建好的表达载体和460 μL DMEM，对照组加入20 μL 构建好的表达载体和480 μL DMEM，静置20 min，然后将实验组和对照组都移到培养皿中均加入4 mL DMEM，在37℃条件下，培养6 h 后换液，培养36 h[11]。

1.2.5 细胞转染后的RT-PCR 扩大培养转染成功的单细胞 细胞在培养皿底部长到95%时，每个板加TRIZol（Roche）试剂3 mL，细胞裂解后进行RNA 提取。RNA提取完成后，测定浓度和纯度符合标准后将其反转录成cDNA[17]。通过PrimerPremier5.0 软件设计Chordin、BMP6和GAPDH基因的引物序列（表1）。

表1 引物信息

通过实时荧光定量PCR 反应测定表达量，实验组和对照组各3 次重复，Chordin相对于内参基因GAPDH的表达量用Ct（2-ΔΔCt）值法计算。利用SPSS 17.0 中t检验进行数据分析[12]。

1.2.6 细胞转染后Western Blot 检测蛋白表达 利用蛋白质印迹法（Western Blotting）将样品分为实验组和对照组，每个组3 个生物学重复。先裂解提取细胞中的蛋白质，内参基因GAPDH、单转染、共转染组分别点3 个胶孔，电泳后对蛋白质进行PVDF 转膜，用转膜电泳槽进行2～3 h，之后封闭蛋白质2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；以1:2 000 的比例对一抗进行稀释，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3 次,每次5 min。以1:2 000 的比例稀释二抗，孵育1.5 h；在暗室中曝光。用ImageJ 软件分析条带，结果用SPSS17.0 统计分析软件进行分析[12]。

2 结果

2.1 目的基因扩增 图1 为凝胶电泳分析结果（2% 琼脂糖凝胶），扩增条带分别位于2 874 bp 和537 bp 处，分别为Chordin和BMP6基因，与已知一致。

2.2 pcDNA3.1 载体单酶切及纯化 利用EcoRI、KpnI酶对pcDNA3.1 单酶切，EcoRI、KpnI 酶切效果良好，pcDNA3.1 载体5 428 bp，可用于后期的实验（图2）。

2.3 表达载体pcDNA3.1 与目的片段重组及鉴定 通过胶回收获得纯净Chordin、BMP6基因片段和pcDNA3.1，利用SoSo 试剂盒分别将其连接。之后转化至大肠杆菌DH5α中，37℃过夜振荡培养。对菌液进行PCR 电泳鉴定结果显示（图3），在2 874 bp 和537 bp 处各有单一明亮条带，为Chordin、BMP6基因。菌液测序后用BLAST 比对，碱基均未发生突变，可用于后续实验。提取重组质粒，如图4 所示，pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-Choedin 重组后质粒大小分别为5 965、8 302 bp，表明重组质粒构建成功。

2.4 细胞培养 每天定时用电子倒置显微镜观察成纤维细胞的生长情况，记录成纤维细胞原代培养的形状变化（图5）。24 h 后细胞逐渐贴壁，并有些许细胞从组织块中游离出来，其呈梭形、圆形。待密度达到90%进行传代培养。传代后细胞仍为梭形。

2.5 实时荧光定量PCR 检测mRNA 的表达 从转染后的成纤维细胞中提取RNA，之后反转录成cDNA，以其为模板，利用上、下游引物对目的基因Chordin、BMP6和内参基因GAPDH片段同时进行PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳检测结果（图6）表明，扩增的条带单一明亮，GAPDH产物大小为125 bp、Chordin产物大小为127 bp、BMP6产物大小为112 bp，与已知大小均相同，可继续实时荧光定量PCR 实验。

目的基因Chordin、BMP6和内参基因GAPDH的扩增曲线、熔解曲线如图7 所示，曲线清晰且只有1 个峰值，表明在实时荧光定量PCR 过程中无二聚体且得到了特异性的扩增产物，可用来进行定量分析。利用SPSS 对两组mRNA 的表达量进行测定和分析，经共转染成纤维细胞后，Chordin基因的表达量极显著提高，BMP6基因的表达量显著降低（图8）。

2.6 Westren Blot 检测蛋白的表达 以成纤维细胞提取的蛋白为模板进行Western Blot。如图9 显示，共转染组的条带明显粗于单转染的对照组，由Image J 软件分析灰度值，灰度值用SPSS 分析。由图10 可知，共转染组Chordin基因蛋白的表达高于单转染组（P＜0.01），共转染组BMP6基因蛋白的表达低于单转染组（P＜0.01）。

3 讨 论

许多研究表明，毛囊的发育依靠一系列的信号分子，这些信号分子在真皮细胞和上皮细胞间穿梭着，介导了这2 个细胞群体间的相互作用，从而促使毛囊的形成[13]。目前，调节毛囊形态发生的信号分子主要分为Wnt 通路、TNF 家族、FGF 家族、BMP 家族、Shh 通路、TGF 家族和NOTCH 通路七类[14]。这些信号分子之间都会相互作用调控，有的是毛囊发育的促进物，有的是抑制物。BMP6属于BMP 家族中的一员，此家族中的基因基本上都抑制毛囊的发育。Meephansan 等[15]研究表明，BMP4基因在绒山羊毛囊生长发育的退行期表达量最高，随着进入生长期其表达量逐渐降低，其表达量随着毛囊的周期性变化而变化。Botchkarev 等[16]于2001 年发现Noggin基因可以间接促进毛囊生长，其作用机制抑制了BMP4基因的活性。Chordin基因也可作为BMPs 类的拮抗剂。有研究表明，Chordin基因在背轴形成中起到了重要的作用，是背轴形成的组件之一。来自组织的Chordin分泌作为骨形态发生蛋白（BMP）的拮抗剂，从而调节其在爪蟾中的活性。Chordin在背侧保持低BMP 活性水平，诱导背部组织形成，如神经外胚层。

之前的研究表明，Chordin对毛囊的发育起到了一定促进作用，而BMP6基因对毛囊的发育起到了一定的抑制作用。但2 个基因间的作用机制还尚未清晰。因此，通过本实验将BMP6基因和Chordin的过表达载体单、共转染至成纤维细胞后测定其表达量的变化。

4 结 论

本研究通过对pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6载体的构建，利用实时荧光定量PCR、Western Blot 技术检测其转染成纤维细胞后的表达量，证实共转染成纤维细胞后Chordin基因的表达量明显升高且共转染组的表达量极显著高于单转染组，BMP6基因的表达量明显下降，且共转染组的表达量极显著低于单转染组，Chordin基因抑制了BMP6基因的表达，BMP6基因促进了Chordin基因的表达，进而确定2 个基因间的作用关系。本实验可作为之前研究作补充，为进一步的分子育种工作提供依据。