朱旭飞 田鹏飞 童甜甜 雷祎凡 何林瑾

摘 要：由于甘草品种混杂且发芽率较低，使得野生甘草种子难以满足生产需求，故需要基于合适的外植体借助组织培养技术进行快速繁殖。对此，笔者通过构建甘草组织快繁体系展开研究，以期有助于解决甘草生产难题，促进甘草产业健康发展。

关键词：甘草组织快繁;外植体;诱导

甘草这一常用药材有着巨大的市场需求，但野生资源供不应求，只能选择人工种植。所以为消除甘草生产瓶颈，提高甘草品质，分别从外植体诱导生成丛状茎和愈伤组织诱导分化两大途径对甘草组织快繁做了研究，并对两者做了比较分析，以期寻求最佳的快繁方式。

一、构建甘草组织快繁体系

（一）基于甘草优良株系建立无菌培养体系

首先，经比较实验，选取了3.2%甘草酸含量的优质甘草株系JA-1为实验材料，按照相关要求配制了4份不同成分的MS培养基。其次，在种子萌发实验中，预先将甘草种子置于H2SO4中浸泡1.5min，随后设定不同的灭菌时间、激素处理、培养温度等条件，分析7d后种子的萌发率。再者，根据实验结果得到，灭菌时间会严重影响甘草种子的萌发率，最佳时间为8min;激素的种类与浓度对种子萌发的促进作用有所不同;培养温度则应控制在25～30℃之间。最后是实验结论，即经硫酸软化后的甘草种子应依次经HgCl2（0.1%）灭菌8min和酒精（70%）浸泡60s，随后接入含有激素1.0mg/L6-BA与0.2mg/LIBA的MS培养基中，置于25～30℃环境下萌发，最终获得80%的萌发率。

（二）甘草组织快繁实验方法

选取前文培养得到的无菌苗为本次实验材料，准备精密电子天平、磁力搅拌器、移液器、自动灭菌锅、微波炉、蒸馏器等设备，以及NH4NO3、KNO3、Na2EDTA、烟酸、乙醇、肌醇、琼脂、VBI、VB6等试剂，开展甘草组织快繁实验。

1.外植体诱导生成从状茎。本次实验采用的是4因素4水平的正交法，即外植体的茎尖、腋芽、新梢以及带芽茎段，浓度（mg/L）为0.5、1、1.5、2的6-BA，浓度（mg/L）为0.05、0.1、0.25、0.5的IBA，浓度（g/L）为10、20、30、40的蔗糖。随后接入MS培养基（0.8%琼脂，pH值5.8）重复三次操作，每个处理的4个瓶子中均带有5个外植体，并在2000lx照度下和25℃的温度下进行培养，4周后对不定芽增值倍数以及高于1cm的新梢率加以统计。

2.愈伤组织的诱导与分化。该实验分两步进行，一是在诱导形成愈伤组织的过程中也采用了正交法，即以外植体类型、6-BA浓度、蔗糖浓度和2，4-D浓度为4个因素，以外植体中下胚轴、子叶、胚根以及芽，浓度（mg/L）为0.2、0.5、1.0、1.5的6-BA，浓度（g/L）为10、20、30、40的蔗糖，浓度（mg/L）为0.5、1.0、1.5、2.0的2，4-D为4个水平进行实验。接种时切取长0.5cm的胚根和胚轴小段，在芽和子叶表面划几个切口，分别接入实验组的培养基（0.8%琼脂，pH值5.8），每组接入5瓶（均带有4块材料），重复以上实验3次，先在25℃下暗培养3～4d，后以2000lx的照度光照12h/d，2周后对愈伤组织的颜色、形态、每块材料净增鲜重平均值和诱导率进行统计。二是选取下胚轴愈伤组织作分化实验，此时采用3因素3水平正交实验，即浓度（mg/L）为0、0.5、1.0的6-BA，浓度（mg/L）为0.05、0.1、0.15的NAA，浓度（mg/L）为0、0.5、1.0的TDZ。切取1cm3的块状愈伤组织置于超净工作台进行培养基接种，每组接种10瓶，每瓶5块材料，置于照度2000lx和25℃下培养，光照时间设为12h/d，于4周后对其分化率进行统计。子叶、胚根以及芽的分化实验同上。

3.生根实验。基于上述两组组织快繁所得的试管苗开始生根实验，即切取无菌苗为长3～5cm且至少带有1个腋芽的茎段，置于无菌操作台用于成分配比不同的生根培养基（0.8%琼脂、pH值5.8、3%蔗糖）的接入，每种培养基接种10瓶，每瓶带有茎段5个，在照度2000lx和25℃下培养20d，其中光照时间设为12h/d，重复3次对其生根率进行观察和统计。

4.炼苗移栽。分别选取生根培养2、3、4、5周的试管苗，保持其他条件不变只打开培养瓶的封口膜，置于弱光环境下3d用于炼苗，为免染菌，清洗根部位置的培养基后再用多菌灵（1000倍）浸泡杀菌2h后移至草炭灰：珍珠岩：蛭石为1：1：1的培养基中，浇水后覆盖塑料薄膜，2周后扎透气小孔。每组移栽50株并要求重复3次，对其成活率加以分别统计。

二、实验结果的分析与讨论

（一）数据分析

数据表明，蔗糖、6-BA、IBA、外植体对丛生芽诱导增值倍数的影响依次增大，其中2000lx照度和25℃条件下，MS+1mg/L6-BA+0.25mg/LIBA+30g/L蔗糖培养基中有效新梢率最高，达到了78.6%。诱导愈伤组织的最佳外植体是下胚轴，最适宜的培养基为MS+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA，此时诱导率与净增鲜重分别为100%和3.4g;同时下胚轴还最易诱导愈伤组织分化，其次为芽。对比生根结果可知，外植体诱导丛生芽与愈伤组织诱导分化相差不大，但前者略高于后者，并在培养试管苗4周后具有最高的移栽成活率。

（二）结论

通过综合比较与分析，判断外植体诱导丛生芽更适合用于甘草组织快繁，而且经后续形态学、细胞学以及SPAP的观察与检测，试管苗并未出现遗传变异，说明该实验下的试管苗遗传稳定性良好。

三、结束语

總之，基于上述实验方法与操作，发现在照度、温度、光照时间一定的情况下，甘草组织快繁会受到外植体类型和激素类型与浓度等的影响，且外植体诱导丛生芽途径不仅在甘草组织快繁中更具优势，而且稳定性良好，值得深入研究。

参考文献：

[1]苏姗.优质甘草组培快繁及遗传稳定性分析[D].河北科技大学，2015.

[2]汪连海.甘草快速繁殖技术及影响因素的研究[D].甘肃农业大学，2015.

基金项目：延安大学2018年校级大学生创新创业训练计划项目“陕北“三大宝”-甘草的组织快繁研究”，编号：D2018089。