刘丽丽 张吉丽

摘 要：近年来，siRNA技术作为一种新型的基因治疗手段，对疾病的治疗起着至关重要的作用，但是siRNA的靶向递送也面临巨大的挑战。设计非病毒纳米载体用于安全、高效地将siRNA运送至靶点是当前研究的热点，本文对目前可递送siRNA的非病毒纳米载体的设计进行了综述，并提出了目前存在的问题，及新型载体设计的展望。

关键词：siRNA;递送系统;聚合物;脂质;多肽;无机纳米颗粒

基因技术的发展日新月异，基因药物的研发也倍受人们关注。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）在1998年由Fire等发现，是一类可以特异性抑制靶基因表达的双链RNA。随着对RNAi的认识不断深入，2001年Elbashir等证明了合成的双链小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）在哺乳动物细胞中可以使靶基因特异性沉默。RNAi已经用于肿瘤、病毒感染、乙型肝炎、癌症等多种疾病的治疗。小干扰RNA（siRNA）是RNAi的效应分子，可在体内诱导RNAi效应。

siRNA由于其体积小、包封率高以及安全性高等特点，已成为具有广阔发展前景的核酸类药物。虽然siRNA具有明显的优点，但是在临床应用中仍存在亟待克服的障碍：siRNA在血清中稳定性较差，易被RNase降解。21-核苷酸的siRNA相对较小，即使是经化学修饰保持稳定的siRNA分子吸收入血后也易经尿迅速排泄。全身给药后siRNA的非特异性分布会明显降低靶组织的局部浓度。siRNA需克服血管内皮壁和多重的组织屏障以达到靶细胞。当siRNA到達靶细胞后还必须有效内吞、细胞摄取和保持细胞内RNAi有活性及完整性。siRNA的脱靶效应。siRNA的免疫原性刺激。

因此，要将siRNA分子成功导入生物体并发挥有效的治疗作用，首先应解决载体问题。大多数研究的解决方案主要有直接局部给药、化学修饰、病毒载体和非病毒载体等多种技术。在现有的解决方案中，非病毒载体具有低免疫原性、易合成、不受基因大小限制、安全性高等优点，明显优于其他给药技术。非病毒载体包括多种载体方式给药，纳米粒载体是由生物材料制备的非病毒载体，粒径大小在1～1000nm。纳米粒在递送siRNA方面具有很多优点，比如提高siRNA在体内的稳定性，具有靶向功能，降低细胞毒性和免疫原性，增加细胞摄取和内化行为等，这些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。因此，文中对siRNA非病毒纳米传递载体的研究进展进行了综述。

一、非病毒纳米载体分类

非病毒纳米载体材料可分为：聚合物类、脂质类和多肽类以及无机纳米材料等。现分别就各类材料中的具体载体设计进行介绍：

（一）聚合物类

由于siRNA带负电，所以带正电的阳离子聚合物可以通过静电引力与之结合，从而完成siRNA的包载。聚合物载体材料又可分为天然高分子聚合物与合成高分子聚合物。

1.天然高分子聚合物。胶原蛋白类是一类天然高分子物质，由胃蛋白酶纯化而来，具有生物可降解以及良好的生物相容性。Takeshita等人通过将等体积的胶原蛋白与siRNA溶液相混合，制备了一种siRNA/胶原蛋白复合物，体外试验测定其具有长循环特性和癌组织蓄积性，并且无免疫原性

环糊精（cyclodextrins，CDs）为多聚糖形成的环状结构，具有良好的生物相容性，不会诱发免疫反应，在动物和人体中的毒性均较低，显示出良好的非病毒基因递送潜质。Davis利用环糊精聚合物所带的正电荷与siRNA通过静电作用组装形成纳米粒，成功地将siRNA递送到靶细胞中。结果表明，利用这种新型的基因递送载体递送siRNA能够显著抑制小鼠转移尤文氏肉瘤的生长速度。

壳聚糖（chitosan）（α（l，4）2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖）是甲壳素脱乙酞化的产物，来源广泛，是一种天然的、无毒、可生物降解并且低免疫原性的阳离子聚合物。鉴于直接使用壳聚糖作为转运载体的递送效率有限，Tripathi等向壳聚糖骨架引入一个低分子量的CP1PEI提高了基因转运能力。

2.合成高分子聚合物。该类化合物主要包括聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）及其修饰物、聚丙交酯乙交酯（polylactide-co-glycolide，PLGA）、以及聚酰胺-胺型树枝状高分子（polyamidoaminedendrimei，PAMAM）等。

PEI聚乙烯亚胺是研究最广泛用于系列核酸的递送载体，分子结构有大量的仲胺基团和叔胺基团，具有“质子海绵效应”、高的电荷密度和较强的缓冲能力，能够保护核酸免受核酸酶的降解，并能辅助核酸从内涵体中释放。PEI分为分枝状和线状两种类型，分枝状的转染效率优于线状;对于不同分子量的交联PEI，低分子量毒性小，但转染率低于高分子量的PEI;转染效率随着偶联的分枝状PEI数量增加而增加。PEI作为siRNA载体的机制为：PEI分子中大量的质子化氨基基团可以与siRNA形成非共价的高电解质分子复合物，被细胞内吞后，通过独特的“质子海绵效应”，增强质子和水的内流，导致细胞内涵体破裂释放出siRNA到胞浆。

PLGA聚丙交酯乙交酯是乳酸和乙醇酸通过酯键连接的共聚物，在体内代谢的最终产物为二氧化碳和水，是一类无毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。研究表明，影响PLGA纳米载体介导siRNA转染的因素有：溶液pH，纳米粒子与siRNA的比例等。

PAMAM是一种有规律的高分散性排列的结构大分子，其结构形状，表面电荷，分子量大小可以调整，可以通过内部封装，表面吸附，化学偶联等来装载药物，可以用来递送siRNA。PAMAM的化学结构表面上有伯胺基，内部有叔胺基，可有效控制粒径在纳米级范围内，而且可引起“质子海绵”效应，促进siRNA在细胞质中释放。

（二）脂质类

脂质体（liposome）是在纳米水平上高度有序的脂质聚合体，一类球形小泡形状的脂质双层膜结构，是由磷脂、胆固醇等膜材包合而成，组织相容性好，制备产物释放容易，是目前广泛使用的一种siRNA递送载体。脂质体一般包括中性脂质体、阳离子脂质体。

核苷酸脂质颗粒（stablenucleicacidlipidparticles，SNALP）即由多种脂质构成。siRNA的SNALP构型现已成功用于小鼠皮下肿瘤的丝/苏氨酸蛋白激酶（Polo-likekinaselike1PLK1）的沉默研究及食蟹猴的载脂蛋白B（apolipoproteinB，ApoB）沉默研究等多项研究中。利用SNALP来靶向乙型肝炎病毒（HBV），结果显示：制得的SNALP中的siRNA在体内的稳定性大大增加，血浆半衰期明显延长，毒性和免疫刺激等不良反应也相应减少。

（三）多肽类

因为多肽的低毒性，被广泛用来用于siRNA的运送载体材料。但是，相对于其他阳离子材料来说，它不能有效的压缩核酸以及在细胞质中释放核酸，因此在用作核酸的载体材料时通常可以选择性的加以修饰。

来自狂犬病毒糖蛋白（RVG）的短肽使siRNA能够经过血管传递到脑部。在RGV肽的羧基末端采用合成的方法接上9个精氨酸残基经纯化、生物素酰化得到的RVG-9R，将其与siRNA在5%的葡萄糖溶液中混合制得RVG-9R/siRNA复合物。给予绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠尾静脉注射复合物后，会引起特定的外源基因沉默，且只在大脑中发现了GFP基因沉默现象，而在肝和脾脏中均未发现，这说明RVG-9R/siRNA复合物具有脑靶向性，结果表明：该siRNA传递载体很有可能应用于病毒性脑炎的治疗。

鱼精蛋白是人工合成的一段富含精氨酸的蛋白质，有很好地抗原结合能力和转载能力。Peer等构建了靶向人淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）的抗体-鱼精蛋白融合蛋白，并证实其能有效转运siRNA并特异诱导沉默效应;并以类似方法将鱼精蛋白-siRNA包裹在脂质体内，通过全身给药途径，成功抑制了小鼠结肠炎模型的疾病进展。

精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸（RGD）是许多黏附蛋白的高度保守氨基酸序列。Todd等采用第三代纳米管接上RGD和PEG间断共载阿霉素（DOX）和siRNA，制得G3-[PEG-RGD]-[DOX]。结果显示：将阿霉素共载于该纳米载体后，与游离阿霉素相比，对恶性胶质瘤U87细胞显示出更大的细胞毒性，该纳米载体所载的siRNA相比于裸siRNA显示出更强的基因沉默效应。

（四）无机纳米颗粒

无机纳米颗粒作为siRNA载体能包裹、浓缩、保护siRNA避免核酸酶的降解，几乎无毒性，制备简易，保存方便，比表面积大，具有良好的生物相容性和可降解性，稳定性好等优点，具有广阔的前景。常用的siRNA递送载体有以下几种：

金纳米颗粒（AuNPs）在用于siRNA递送载体的过程中，易于被细胞摄取，且无明显的细胞毒性，可直接通过离子作用、共价键或物理吸附作用与药物、siRNA等相结合，或通过结合PEG或其他形成保护膜的分子，阻止体内纳米颗粒的聚合，确保给药后更长的药物循环时间。

单壁纳米碳管和多壁纳米碳管也是具有应用前景的基因靶向递送材料。Podesta等制备了胺基修饰的MWNT携带siRNA的转运载体，成功延长了荷瘤裸鼠的生存期。

Mccarroll等应用脂质和树状聚合物使SWNT功能化，并将其与siRNA形成的复合物注射于小鼠体内，有效沉默ApoB的表达，且注射后48h80%的复合物已从体内清除，证实SWNT并未引起siRNA的聚合，也未抑制体内的生物降解和药物清除过程。

尽管无机纳米载体金纳米颗粒以及单壁纳米碳管和多壁纳米碳管等拥有广阔的应用前景，但细胞毒性也是要克服的问题。采用表面修饰方法可以提高转染效率，降低毒性，使其作为siRNA的非病毒载体成为可能。

二、新材料的构想和设计

siRNA具有安全性高、免疫原性低、不受基因大小限制、合成快速等优点，在递送过程中，医药工作者们对于载体开发方面做了大量的工作，但是我们由以上几类siRNA的非病毒纳米载体的了解中，我们可以看到不同的非病毒纳米载体有不同的优缺点，因此，将多种载体联合应用或者设计新型的载体材料势在必行。

新近报道的一种螺旋状噬菌体外壳蛋白融合肽DMPGTVLP作为独特的配体递送Liposome/siRNA，有较好的靶向性，有望得到广泛应用。YelenaVachutinsky等人曾设计了一种聚合物胶束用于靶向新生血管的质粒DNA的传递，在其基础上构想了一种新的siRNA的载体材料。制备用二硫键交联的嵌段共聚物胶束，可以提高胶束在细胞外的稳定性，将壳聚糖巯基化，再与聚乙二醇形成共聚物。最后经固化交联作用形成稳定的胶束。由于聚乙二醇与壳聚糖具有良好的生物相容性与生物可降解性，而RGD作为一种整合物受体识别模块具有良好的新生血管靶向性，推测该结构将会成为一个比较理想的siRNA的传递系统。

三、小结与展望

siRNA作为一种疾病的治疗药物在研究和应用的方面现已经取得很大成功，进一步深入的研究其机制，设计更加优质的载体运载siRNA是目前医药工作者以及科研人员的努力方向。随着现代科学技术的发展、现代药剂学和分子生物学等学科的不断进步，我相信在不久的将来，siRNA體内递送系统的研究工作将会取得突破性进展。

参考文献：

[1]FireA，XuS，MontgomeryMK，etal.Potentandspecificgeneticinterferentbydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[2]ElbashirsM，LendeckelW，TuschlT.RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs[J].GenesDeli.2001，15（2）：188-200.

[3]XieFY，WoodlemC，LuPY.HarnessinginvivosiRNAdeliveryfordrugdiscoveryandtherapeuticdevelopment[J].DrugDiscovToday.2006，11（2）：67-73.

[4]龔建勇.小干扰RNA非病毒载体研究进展[J].药品评价.2013，10（24）：006-01（九）.

[5]KimDH，RossiJJ.StrategiesforsilencinghumandiseaseusingRNAinterference[J].NatRevGenet.2007，8（3）：173-184.

[6]MaJB，YuanRY，MeisterG，etal.Structuralbasisfor5-end-speci?crecognitionofguideRNAbytheA.fulgidusPiwiprotein[J].Nature，2005，434（7033）：666-670.

[7]MichaelH，etal.SmallinterferingRNA（siRNA）deliveryintomurinebonemarrow-derivedmacrophagesbyelectroporation[J].JImmunologicalMethods，2010，353（1-2）：102-110.

[8]LimMJ，MinSH，LeeJJ，etal.TargetedtherapyofDNAtumorvirus-associatedcancersusingvirus-activatedtranscriptionfactors[J]，MolTher，2006，13（5）：899-909.

[9]HammondSM，BernsteinE，BeachD，etal.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells[J].Nature.2000，404（6775）：293-296.

[10]TakeshitaF，MinakuchiY，NagaharaS，etal.EfficientdeliveryofsmallinterferingRNAtobone-metastatictumorsbyusingatelocollageninvivo[J].ProcNatlAcadScUSA，2005，102（34）：12177-12182.

[11]DavisME，ThefirsttargeteddeliveryofsiRNAinhumansviaaself-assembling，cyclodextrinpolymer-basednanoparticle：fromconcepttoclinic[J].MolPharm，2009，6（3）：659-668.

[12]DavisME，ZuckermanJK，ChoiCH，etal.EvidenceofRNAiinhumanfromsystemicallyadministeredsiRNAviatargetednanoparticle.Nature，2010，464（7291）：1067-1070.

作者简介：刘丽丽（1979-）女，讲师，研究方向：畜禽养殖及疾病防治。

通讯作者：张吉丽（1992-）女，博士，主要从事抗寄生虫药物研发工作。