姜 静,刘丽娜,张 鑫,赵 丹,*

(1.黑龙江大学生命科学学院微生物省高校重点实验室,黑龙江哈尔滨 150080; 2.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨 150500)

自然界中普遍存在两种果聚糖,一类是levan果聚糖,它是一种从植物或微生物中提取的天然高分子多糖聚合物,主要以β-(2,6)糖苷键作为主链、少量β-(2,1)糖苷键作为支链[1]。另一类是菊粉(Inulin)果聚糖,由多个果糖分子通过β-(2,1)糖苷键连接成(图1)。果聚糖由广泛的微生物作为胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)和有限的植物物种作为非结构性存储碳水化合物产生的。在微生物中,这些聚合物既有助于EPS基质的形成,还有助于微生物生物膜的形成[2-3]。

图1 果聚糖的分子结构Fig.1 Structures of fructans:(A)levan[6],(B)inulin

由于levan果聚糖能够对一些肠道内有益宿主健康的微生物起到选择性刺激或促进的作用,因此对宿主健康有益[4]。Levan果聚糖具有生物相容性、生物降解性、可再生性、抗氧化、抗炎、抗癌、高血糖抑制剂等生物活性和生理功能[5],因而被认为是一种益生素,使levan果聚糖成为具有竞争力的商业合成聚合物替代品。除此之外,levan果聚糖的主干结构使其成为良好保健品配方的优选成分,在安全性上更可靠。Levan果聚糖多样的益生功能使其在生物医学、工业、食品和制药等领域的开发利用拥有巨大的潜力。

1 Levan果聚糖的性质和生物合成

1.1 Levan果聚糖的性质

Levan果聚糖是一种由d-果糖-呋喃糖基残基组成的天然、具有功能性和生物活性的分子,在核心和支链上分别以β-(2,6)键和β-(2,1)键进行连接,并在链末端带有d-葡萄糖基残基[7-8]。生物体可以依靠不同的底物产生具有结构相似的levan,但是重复单元的聚合和分支的程度各不相同。来自唾液链球菌(Streptococcussalivarius)的levan分支度为10%,多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymixa)为12%,而产果聚糖气杆菌(Aerobacterlevanicum)为9%[9]。肠杆菌(Brenneriasp.)利用果聚糖蔗糖酶(Levansucrase,EC 2.4.1.10)合成的levan平均分子量高达1.41×108Da,而在其中没有检测出果糖单体的分支摩尔分数,表明它仅由β-(2,6)d-果糖-呋喃糖基重复单元组成[6],与嗜盐单胞菌(Halomonassp.)产生的线性果聚糖相似[10]。除此之外,levan由于具有β-(2,6)键,使得levan既溶于水又溶于油,但不溶于大多数有机溶剂。Levan的性质与其他聚合物存在较大的差异,levan在水中不会溶胀,从而能够形成水胶体[11],使其在面包的烘焙中得到广泛的应用,改变了面团的粘度和弹性,进而改善了面包的体积和面包屑质地[12]。

Levan具有较低的特性粘度,表观粘度可影响levan的流变学特性。此前的研究发现,分子量在1600～2400 Da之间的levan在水中的固有粘度为0.07～0.18 dL/g[13],当处于约3%低浓度的levan水溶液中,Brenneriasp.、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)呈现牛顿行为。而当处于约6%～12%高浓度levan的水溶液时,表现出非牛顿特性。在1%～8%浓度的levan溶液中,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)显示完全牛顿行为[9],其原因在于不同的levan支链、聚合物分子量或粒子间相互作用可能导致不同的流变行为。此外,levan的剪切变稀特性在生产乳制品、食用糖浆等食品工业中可发挥巨大的作用[14]。

1.2 Levan果聚糖的生物合成

Levan广泛存在于细菌中,在一些植物、酵母、真菌中也同样存在,其生物合成通常由levansucrase进行催化[15]。Levansucrase的生物合成发生在细胞内,在细胞周质空间积累,然后通过信号肽裂解及蛋白折叠(革兰氏阳性细菌,G+)或通过信号肽途径自身启动的机制(革兰氏阳性细菌,G-)从细胞中排泄到周围环境[16-17]。

Levansucrase可以催化三种反应:水解、转糖基和聚合,蔗糖在其中既可充当唯一底物同时还可充当果糖基受体和果糖基供体[18]。在微生物中,Levansucrase催化合成levan,实际上是一个将己糖基从供体分子转移到受体分子的过程,单个呋喃果糖基单元被添加到生长levan多糖链的非还原性果糖末端的C6羟基上[19]。如图2所示,果糖基供体(通常是蔗糖分子的水解反应)中糖苷键断裂的同时,酶的亲核基团羰基进攻蔗糖的异头碳导致共价果糖基-酶中间体的形成和葡萄糖的部分释放。随后,果糖基部分从酶转移至受体分子,果糖-受体分子生长成levan多糖链,levansucrase发生聚合反应,不断向生长中的levan多糖链中添加果糖亚基,完成levan的合成。当水分子作为果糖基中间体的受体时,发生水解反应,果糖被释放到反应介质中;当葡萄糖作为果糖基中间体的受体时,发生蔗糖的置换;受体为乳糖时发生低聚乳果糖的合成反应;当受体为levan时则发生多糖聚合反应[20-21]。

图2 Levan的生物合成Fig.2 Biosynthesis of levan注:Glc,葡萄糖;Fru,果糖。

对于levansucrase是如何通过果糖基中间体来合成levan,其生物合成转化的机制和结构基础仍然不清楚。一般认为低分子量(Low molecular weight,LMW)的levan分子量在80～50000 Da左右,而高分子量(High molecular weight,HMW)的levan则分子量为>50000 Da。在LMW或HMW产物的合成过程中,可能涉及酶的非保守区域的过程伸长或非过程伸长机制[22]。2018年,Carbajal等[23]以蔗糖以及内在不同反应固有受体作为底物,探究B.subtilislevansucrase合成LMW levan的非过程延伸的传递反应网络。如图3所示,早期阶段先开始形成1-蔗果三糖(1-kestose)、6-蔗果三糖(6-kestose)和新-蔗果三糖(neo-kestose),它们是转果糖基化的第一个产物,随后6-kestose和1-kestose延伸到相应的levan系列,neo-kestose积累,只用于合成6-新-蔗果四糖(6-neo-nystose)。当葡萄糖和果糖达到足够的浓度后成为果糖基受体,随即产生ercose、菊粉二糖(inulobiose)、blastose和果聚二糖(levanbiose)。最后,在蔗糖消耗阶段,初级中间产物neo-kestose和6-neo-nystose作为果糖基残基的供体,产生blasto-FOS,增加了这些次级中间产物的浓度。因此,低分子量levan为一组果糖低聚糖(Fructooligosaccharide,FOS)系列,不同阶段受不同引发剂延伸而成,且在反应的不同阶段受不同受体的调节。与之相似,2019年,Elena等[24]在探究来自B.subtilis和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)在合成LMW levan过程中,发现溶液中的levan结构对其形成具有很大的影响。

图3 B. subtilis levansucrase合成低分子量levan的中间体/产物和果糖基化/水解反应图Fig.3 Diagram of the intermediates/products and fructosylation/hydrolysis reactions inherent to the B. subtilis levansucrase non-processive mechanism for LMW levan synthesis注:sucrose,蔗糖;Glucose,葡萄糖;Fructose,果糖;1-kestose,1-蔗果三糖;6-kestose,6-蔗果三糖; neo-kestose,新-蔗果三糖;levanbiose,果聚二糖;inulobiose,菊粉二糖;1,6-nystose,1,6-真菌四糖;6,6-nystose,6,6-真菌四糖;6-neo-nystose,6-新-真菌四糖。

2 微生物levan果聚糖的益生功能

2.1 促进益生菌的增殖

益生元是食品工业中有益的功能性成分，原因在于其可被益生菌所发酵，促进益生菌的生长，从而对宿主产生有益作用[25-26]。长期以来,益生元的作用主要与促进双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)的生长有关。文献资料表明,这两种细菌均可利用levan进行生长[27]。从这方面来看,levan被认为是潜在促进益生菌生长的候选组分。Adamberg等[28]探究了由丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.)生产的levan对粪便细菌群的动态调节作用,发现levan可以作为胃肠道微生物群的选择性生长基质,并且levan的加入明显促进了粪便微生物群中拟杆菌(Bacteroides)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、链球菌(Streptococcus)和粪小杆菌(Faecalibacterium)的生长。Franck等[26]发现旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)产生的高分子量levan,可以促进Bifidobacterium的生长。除此之外,levan在肉鸡的饲粮中,能够使肉鸡后期的生长性能得到改善、盲肠LAB和Bifidobacterium的浓度升高以及盲肠E.coli和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的浓度降低[29]。Levan是FOS的一种前体物,levan酸水解后可以转化为FOS,从而刺激内源性Bifidobacterium的生长,进而显著调节结肠微生物群[30]。同样,Guolin等[31]以及Dom等[27]观察到,通过levan的酸水解得到的levan型FOS可以被不同的Bifidobacterium代谢,从而进一步展示了levan的益生潜能。

2.2 抑制有害菌的生长

2.2.1 抑制食源性致病菌及抗病毒活性 Levan能够抑制食源性致病菌及抗病毒。Bo等[32]首次提出levan对食源性致病菌具有广谱抗菌作用的观点,并且发现levan分子量不同,呈现不同的抗菌特性。测试的腐败菌和致病菌包括B.subtilis、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。测试结果表明:低分子量levan对所有测试的致病菌和腐败菌具有强烈的抑制作用。而高分子量levan,除了B.subtilis、S.typhimurium和E.aerogenes外,能够有效地抑制大多数测试的腐败和致病细菌的生长。类似地,Abid等[33]发现来自特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)的levan对E.coli、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和L.monocytogenes均有抑制作用,其中对E.coli抑制效果最强。同时,levan还能够破坏预形成的致病菌生物膜,并且增加levan浓度,膜的破坏活性也随之加强。除此之外,levan还具有抗病毒活性,Esawy等[34]从不同来源的蜂蜜中分离出M、K、A、C、E和G 6株芽孢杆菌(Bacillussp),发现K、M、E株产生的levan对致病性禽流感呼吸道病毒(HPAI、H5N1)的活性具有明显的抑制作用,甚至可以灭活,而A、M株产生的levan对肠道病毒(腺病毒40型)的活性具有抑制作用。

2.2.2 Levan的粘附作用 EPS可以作为一种粘附因子,能够帮助LAB在肠道黏膜上定殖[35],从而对人体肠道环境有一定的修复,促进其消化吸收等[36]。最近研究发现,EPS的代谢物levan可以作为产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)的抗粘附剂。ETEC的致病过程通常分两步:粘附素的定殖过程和肠毒素的致病过程[37]。ETEC通过表面定殖因子附着在肠上皮细胞上发生定殖,随即产生肠毒素破坏肠液的稳态,进而引起腹泻[38]。基于这种感染机制,ETEC与宿主细胞的粘附被认为是感染过程中的一个重要步骤[39]。而levan作为ETEC的抗粘附剂,其机理为:通过EPS紧密黏附在ETEC细胞上而阻断ETEC粘附素与宿主受体相互作用,从而对ETEC引起的腹泻起到明显的治疗作用。来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的levan抗黏附活性与分子量及分支程度相关联,levan分子量高分支程度低,与抗黏附活性呈负相关,因此levan展现出可作为一种预防腹泻的抗凝剂的潜力[31]。

2.3 激活免疫因子

随着功能性多糖对人体健康益处被不断阐明,多糖和多糖蛋白复合物因其具有免疫调节和抗癌作用而受到生物化学和医学领域的广泛关注,使果糖的研究再次引起了人们的兴趣。近年来,研究学者们不断发现levan具有直接或间接调节免疫系统的功能。Levan对巨噬细胞、B细胞和T细胞都具有免疫调节作用,并且不同来源的levan由于结构的差异而体现不同的免疫调节作用。来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的levan作用于HT-29细胞分别测定了IL-4、IL-10、IL-12和TNF-α诱导水平,发现levan对IL-10、IL-12和TNF-α没有诱导作用,而对IL-4产生了诱导作用,揭示了IL-4是一种重要的抗炎细胞因子,显示了levan潜在的免疫调节作用[40]。以博氏拟杆菌(Paenibacillusbovissp.)为原料合成的levan对小鼠脾脏细胞的免疫调节中,发现在测试的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFNg和TNF-α)中,只有TNF-α的表达显著增加,由此通过上调TNF-α表达水平显示出免疫刺激活性,从而证明levan对小鼠淋巴瘤有抑制作用[41]。从发酵大豆中提取的levan在体外通过TLR4诱导巨噬细胞,产生TNF-α和IL-12 p40活性,并且levan作为一种有效的IL-12诱导剂,可抑制IgE产生的过敏性炎症。除此之外,当levan通过酸水解分解为单果糖时,levan的免疫刺激能力完全丧失,证明β-(2,6)-果聚糖骨架对levan的免疫调节作用至关重要[42]。

Levan作为一种免疫刺激剂,在鱼类的免疫系统中被认为是安全有效的。Levan的作用是通过快速激活非特异性防御机制,保护鱼类免受致病病原体的侵害[43]。Dina等[44]对鲤鱼幼鱼投喂添加levan的饲粮,结果发现添加levan的鲤鱼幼鱼的红细胞和血红蛋白含量显著增加,除此之外,levan还可以提高鲤鱼对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)腹腔内感染的存活率,相对存活率随食物中levan浓度的增加而增加,证明levan可以作为鲤鱼幼体的膳食免疫刺激剂。与之相似,Huang等[45]研究发现添加levan的饲粮均显著降低石斑鱼肠道中需氧菌和弧菌的存活数量,还刺激了血清总蛋白水平、球蛋白水平和溶菌酶活性,从而使石斑鱼的生长性能和抗病性得到有效的提升。

2.4 降低血糖和血脂

自Burkitt和Trowell的膳食纤维假说中提出:膳食纤维在降低心血管疾病、糖尿病等方面具有重要的作用之后[42],人们针对糖以及糖类的不可消化低聚物等膳食纤维开展了大量的研究。Dahech等[46]研究发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)产生的levan对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有降血糖的作用。将四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠以口服方式灌服levan后,发现血浆葡萄糖水平明显下降,糖原水平明显升高。同时,levan还降低了糖尿病小鼠的肝脏、肾、胰腺和心脏中硫代巴比妥酸反应物质含量,且使超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的含量得到提升。此外,糖尿病小鼠的肝脏和肾脏指标毒性,包括碱性磷酸酶、天门冬氨酸转氨酶和乳酸转氨酶活性以及总胆红素、肌酐和尿素水平分别均有所降低。总体而言,levan被证实可抑制由糖尿病引起的高血糖,从而对成年小鼠的糖尿病具有有效的预防和治疗作用。

Belghith等[47]探究来自B.licheniformis的levan对高胆固醇小鼠的降血脂作用,口服作用于高胆固醇小鼠,测定血浆抗氧化酶和脂质谱,发现显著增加了小鼠肝组织中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性,说明levan对总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯都有明显的正向影响。而硫代巴比妥酸浓度、天门冬氨酸转氨酶、乳酸转氨酶浓度和总胆红素活性均发生显著降低,由此证明levan具有潜在的降血脂和抗氧化作用。

2.5 其他益生功能

Levan可以促进益生菌的增殖、抑制有害菌的生长、激活免疫因子、降血糖及血脂,这些优异性能使levan成为一种多功能聚合物。除此之外,levan还具有抗肿瘤、抗氧化等功能[48],在抗肿瘤活性相关的研究中,发现levan分子量大小和分支程度起决定性因素。Yoo等[49]从产左聚糖微杆菌(Microbacteriumlaevaniformans)中提取的levan对胃细胞瘤(SNU-1)、肝细胞瘤(HepG2)及恶性肉瘤细胞(S180V)等八种肿瘤细胞株均具有一定的抗性。同年,Yoon等采用菊粉酶对M.laevaniformansKCTC 9732进行分支结构的改变,发现分支结构改变后的levan展现出对肿瘤细胞的抗性相对较低[50]。这可能是由于β-葡萄糖醛酸酶活性会随着levan摄入量的增加而增加,同时levan还降低了盲肠内pH,增加结肠中Bifidobacterium和短链脂肪酸的数量,从而促进LAB的生长,使结肠能够抵挡致癌物的侵袭[21]。

Levan除了在抗肿瘤方面有一定功能外,其在抗氧化方面也具有潜在的作用。据报道,很多不同来源的levan具有抗氧化活性,使其在化妆品及医药行业有很强的需求[51-52]。目前大量研究表明,levan的抗氧化能力具有浓度依赖性,浓度越高,抗氧化能力越强。使用DPPH自由基清除法测定来源于木醋杆菌(Acetobacterxylinum)的levan的抗氧化活性,以标准抗氧化剂抗坏血酸为对照,在1 mg/mL相同浓度下,抗坏血酸表现出100%抗氧化活性,而A.xylinumlevan表现出81.26%的抗氧化活性。当A.xylinumlevan浓度为1.25 mg/mL时,表现为100%抗氧化活性[53]。同样的,采用羟自由基清除法测定了来源于Leu.mesenteroides的levan体外抗氧化活性。实验表明,在6 mg/mL的浓度下,levan的清除率几乎达到100%,显示出作为潜在抗氧化剂的能力[54],从而证实了levan可以作为一种强抗氧化剂用于医药和生物医学应用。

此外,大量文献证实,levan的磺酰化、乙酰化、硫酸化等衍生物与天然levan相比,具有更高的抗肿瘤能力。Bayoumi等[55]研究发现来自枯草芽孢杆菌硫化的levan具有明显的抗肿瘤活性。张颖等[56]对来自B.amyloliquefaciens的levan进行乙酰化、磺酰化、硫酸化修饰,结果发现经化学修饰后,levan抗氧化活性以及对宫颈癌细胞(Hela)的抑制活性均有所增加。

3 结语

微生物来源的levan果聚糖具有促进益生菌的增殖、抑制有害菌的生长、激活免疫因子、降血糖及血脂等重要的生物学功能,在食品加工、生物制药以及化妆品等领域具备极大的市场价值。然而,依旧存在一些问题:首先,levan果聚糖在工业生产上由于有限的生产策略,使其在商业规模的医疗和制药领域的利用率相对较低。其次,关于levan降胆固醇的报道相对较少,对于其机理的猜想可能是由于类固醇的肠肝循环紊乱所致,然而确切的机制还需要进一步的研究来阐明,为接下来开发关于降胆固醇类药物提供依据。针对存在的问题,提出以下建议:为了降低成本,提高levan产量,可以从优化培养条件或通过一些生物技术手段来提高levan的产量。除此之外,很多与levan衍生物相关的学术研究,可以考虑从其衍生物角度入手,开发更多的预防及治疗药物,以便将levan更多地用于制药领域的商业化生产。实际上,据报道levan已经作为抗氧化剂以及抗肿瘤药物进入市场,但作为医疗制药领域仍具有更大的潜力。