韩 爽,张 健,井月欣,王 萍,3,王共明,刘 芳,刘 奎,刘海超,赵云苹

(1.山东省海洋资源与环境研究院,山东烟台 264006; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306; 3.烟台大学生命科学学院,山东烟台 264005)

目前,全球工业酶的销售额超过数十亿美元,且预计在未来会有进一步的增长[1]。蛋白酶是三大工业酶之一,广泛应用于洗涤剂、皮革、医药等各个行业[2]。蛋白酶分布广泛,主要来源于植物的茎叶、果实,动物的腺体、内脏以及微生物[3]。随着蛋白酶需求量的逐年攀升,动植物源的蛋白酶已经难以满足人们的需求,微生物源蛋白酶却显示出诸多优势[4]。与传统的蛋白酶提取方法相比,采用微生物发酵法生产蛋白酶不仅不受原料限制、营养需求低,且提取工艺简单、周期短、蛋白酶回收率高,更容易实现自动化大规模生产,具有广阔的市场价值和突出的社会环保效益[5]。

从20世纪80年代起,微生物蛋白酶取代了很多动植物蛋白酶,在食品制作、洗涤剂生产、皮革软化、纸浆和纸张生产等行业都发挥着重要的作用[1]。近年来,我国着力于基础研究,在微生物蛋白酶的理化性质、作用机制以及纯化技术等方面的研究均有重大突破。国外注重高产菌株以及蛋白酶新产品的开发,在传统实验与诱变技术和基因工程技术的结合上发展迅速[6]。从极端环境中分离微生物并制得微生物蛋白酶,结合基因工程、酶工程及诱变技术优化菌种选育方法、增加蛋白酶的开发利用将仍是研究热点。本文针对微生物源的选择、目的菌株的筛选培养方式、蛋白酶的纯化方法、酶活力的调控及微生物蛋白酶的应用等研究热点,进行了归纳总结,并对下一步的研究进行了展望。

1 蛋白酶的微生物源及其类型

动植物蛋白酶,在很多行业中发挥着重要的作用,但该类蛋白酶往往生产成本高、产酶效率低,难以实现大规模生产。微生物是目前蛋白酶的优良来源、主要生产者[7]。产蛋白酶的微生物种类繁多,但作为工程菌需要满足无毒、无致病性,可以在短时间内生产大量蛋白酶[8]等要求。经过多年的发展,目前用于生产蛋白酶的微生物主要有细菌、霉菌和放线菌[4-5,9],其常见的产蛋白酶菌株以及所产蛋白酶类型见表1。

表1 微生物源及其所产蛋白酶类型Table 1 Microbial sources and types of proteases produced

如表1所示,细菌中有相对较多的菌株可用于蛋白酶的生产,但部分种属的菌株存在毒性和致病性,在进行工业生产时需经筛选。霉菌的应用历史久远,在酱类制品的制作中发挥着重要的作用[23]。有关放线菌所产蛋白酶的研究近年来也不断增长,受到越来越多的关注。

蛋白酶的分类方法众多,比较常见的是根据酶的最适pH及温度进行分类。基于不同最适pH,蛋白酶可以分为酸性、中性和碱性蛋白酶[9]。霉菌所产蛋白酶中,酸性蛋白酶种类更多,酶的特点也更为显著。毛霉和根霉所产的酸性蛋白酶凝结活性强,专一性较高;米曲霉所产的酸性蛋白酶酶活力高,有助于蛋白质水解产生风味性物质[18-19]。从烟曲霉中提取的酸性蛋白酶耐酸性较强,稳定性较好[24]。细菌源蛋白酶中,碱性蛋白酶的研究更充分、应用范围更广阔。虽然可以分泌碱性蛋白酶的微生物种类繁多,可以从盐碱土、沙地、深海等偏碱性环境中分离获取[9],但目前工业上主要应用的菌株仍是芽孢杆菌[11-13,16,25]。芽孢杆菌除了是碱性蛋白酶的主要来源外,也是中性蛋白酶的主要来源,截止至目前,全球的大约50%的中性蛋白酶由芽孢杆菌生产[26]。中性蛋白酶因可在中性pH条件下水解动植物蛋白生成小分子多肽[27-28],可用于酿造业等发酵行业[29]。放线菌蛋白酶是近年来新兴的蛋白酶,主要类型有中性和碱性,这两类酶在扇贝加工废弃物处理中有所应用[30]。当前研究显示,中性蛋白酶的开发较早,已较为成熟,目前有关碱性蛋白酶的研究较多,且发展迅速,而酸性蛋白酶的研究有限,有待进一步的开发。

根据最适温度不同,可以将蛋白酶分为高温蛋白酶、中温蛋白酶和低温蛋白酶。由于高温和低温蛋白酶在特殊温度条件下的良好稳定性,近年来的相关研究呈明显的上升趋势。低温蛋白酶可以从嗜冷微生物中获得,由于生长环境特殊,大多海洋微生物具有耐盐、耐高压和嗜低温等独特的生理特征,可以大量分泌低温蛋白酶,是其良好来源。秦皇岛海域海水样品中筛得的假交替单胞菌,可以产低温中性蛋白酶,该酶遗传性能稳定,发酵周期短,环境适应性强,发酵液酶活可达1140 U/mL[14]。除低温蛋白酶外,高温蛋白酶也是一类比较特殊的蛋白酶,最适温度在60 ℃以上,往往取自极端环境的微生物中。由于特殊的适应性,此类蛋白酶都具有热稳定性好、耐有机溶剂、耐变性剂和半寿期长等优良的性质[31]。有学者从海洋细菌FirmusbacillusCAS7中分离得到高温蛋白酶,该酶有高度的稳定性,比活力为473.4 U/mg[15]。枯草芽孢杆菌所产的耐高温的丝氨酸蛋白酶,在60 ℃下仍可以保持稳定性,加入洗涤剂后极大地提高了洗涤剂的清洁能力[17]。除细菌外,高温放线菌也可产高温蛋白酶,该蛋白酶在60 ℃仍保持活性,可以用于含角蛋白废弃物的处理[19]。在目前的工业生产中,中温蛋白酶是主要的工程酶,具有成本相对较低、开发相对成熟的优点,但也暴露出了稳定性不佳、适应性差等问题。由于低温以及高温蛋白酶具有稳定性高、适应性强等特点,逐渐成为研究热点。

另外,还可根据作用底物的不同进行分类,例如以弹性蛋白为底物的弹性蛋白酶,具有维护血管弹性、延缓皮肤衰老和保持肉类口感等多种作用,得到许多行业的青睐。而目前我国弹性蛋白酶的生产主要来源于动物的胰脏,其提取、分离和纯化工艺较复杂,使得弹性蛋白酶的得率和质量相对较低,导致其价格昂贵[32]。寻找新的弹性蛋白酶源是人们多年一直关注的问题,微生物无疑是一个很好的选择。也可根据活性中心的不同进行分类,例如活性中心含有金属离子的蛋白酶被称为金属蛋白酶。细菌所产的金属蛋白酶种类众多、易于分离、产量大,研究前景广阔[33]。

充分利用生产蛋白酶的传统工程菌,不断筛选优化传统菌株并继续寻找新的微生物源,是微生物蛋白酶的一大发展方向。

2 微生物源的筛选及培养

在自然界中目标菌株几乎不会以单一菌株的形式存在,需要对菌株进行分离纯化后才可将之用于提取所需的蛋白酶,目标菌株的分离纯化过程通常如下所示:

菌种采集→无菌环境下接种→分离纯化→置于适宜环境下培养→得到纯种菌株,进行保藏

微生物筛选的过程包含初筛和复筛[34]。初筛和复筛都可以根据目的菌的特性选择特殊培养基进行筛选。微生物筛选的方法很多,目前比较常用的倾注平板法、涂布平板法、平板划线法、富集培养法,都是通过菌种稀释的原理进行菌种分离。而厌氧法是根据微生物好氧和厌氧性的不同进行菌种分离的一种方法。在产蛋白酶菌种的筛选中,大多选用酪蛋白培养基,酪蛋白水解圈越大,产蛋白酶能力越强[34-36]。

对于筛选过后的微生物扩大化培养,培养基应保证适宜的营养物浓度、合适的pH、适当的水分,才可以维持微生物的正常生长。不同菌株的最佳培养条件千差万别,例如酱类生产中常用雅致放射毛霉和五通桥毛霉,它们的培养基最佳配比相似但也略有不同,前者培养基中的黄豆粉添加量要低于后者,而KH2PO4、CaCl2的添加量却略高于后者[37-38]。除根据菌种特点进行配制的培养基外,也可以直接在微生物原本的生长环境中取材进行初筛后的扩大化培养,例如海洋微生物可直接取其生长海域的海水杀菌后进行菌种培养[39]。

部分野生菌经筛选之后可以满足工业生产要求,直接进行应用,但也有菌株需经诱变筛选后再进行培养。目前,常见的菌种诱变方式包括物理诱变和化学诱变,它们都是通过遗传物质的突变进行菌种诱变。其中,物理诱变方便快捷,一直沿用至今,常见的物理诱变剂有:紫外线、X-射线、γ-射线、激光、微波等[40]。相对物理诱变,化学诱变更为复杂,近年来呈高速发展趋势,烷化剂、天然碱基类似物、叠氮化物等是常见的化学诱变剂[41]。除可使用单一的方法进行诱变之外,多种方法联用可以结合各种方法的优势,也是目前常见的诱变育种方法[42]。

目前,国内仍然多选用传统方法进行微生物菌株的筛选和培养,并发现了一定量的微生物新物种,但与此同时也应结合诱变技术,得到生产性能更强的工程菌,促进蛋白酶的生产。

3 微生物蛋白酶的纯化

工业生产中往往需要高纯度的胞外蛋白酶,尽管进行粗分离相对简单,但还要进行复杂的提纯分离才可得到纯度较高的蛋白酶。

进行发酵培养之后,取发酵液进行离心处理,上层清液即粗酶液[43-45]。也有研究指出,在取发酵液后加入絮凝剂进行沉淀,可以直接得到澄清粗酶液,这种操作较之前的离心处理更为温和。同时,根据不同微生物源的大小选择不同的滤膜进行过滤,也可以将微生物除去,得到粗酶液[46]。制得粗酶液后需要对其进行除杂处理。因为蛋白酶的化学本质是蛋白质,故常采用分离蛋白质的方法进行蛋白酶的纯化处理,常用方法详见表2。

表2 蛋白酶纯化处理方法Table 2 Purification methods of protease

表2中提及的柱层析法是实验室进行酶纯化的常用方法,例如离子交换层析和凝胶过滤层析等。相关研究采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdex 75凝胶柱层析的方法,从酱油大曲中纯化得到的耐盐蛋白酶,酶活力保留为54.39%左右[47]。而在从云南莴笋尖中分离制备酪氨酸酶时,相关研究也采用了二乙氨基乙醇琼脂糖凝胶(Diethyl-aminoethanol Sepharose)离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等相结合的方法,得到了比活力为20.62 U/mg的酶[48]。在众多方法中,超滤法等物理性分离手段操作简单、酶活力保存好,但纯度不高;化学分离手段分离纯度高,但酶活性保存较差,故“集成分离纯化法”越来越多地被采用。其通过将多种分离纯化方法结合起来,使各技术之间优势互补,可以在不同处理阶段采用不同的方法以得到更高纯度的目的酶。

4 蛋白酶酶活力的调控

4.1 通过外部因素进行酶活力的调控

底物浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂是影响酶活力的主要外部因素,通过对它们进行调控可调控酶活力。在实际生产中,上述因素对发酵效果也有显著影响。无论是用于生产纳豆的纳豆菌[49]还是用于提高小米糠蛋白应用的芽孢杆菌[50],温度和pH对其中的酶活力都有重要影响。除了上述对酶活力具有普遍影响的因素外,工业化生产中也会产生很多其它影响酶活力的因素,例如底物的组织状态对蛋白酶活力有重要影响。酱油生产中,影响所用蛋白酶活性的主次顺序为浸豆时间>蒸料时间>制曲时间[23,51]。浸豆时间和蒸料时间都会对底物大豆的组织形态产生明显影响。通过控制料水比来调控蛋白酶的活力,用枯草芽孢杆菌提高豆粕的利用率[52],也是控制底物的组织状态来调控蛋白酶活力。在青贮过程添加的青贮添加剂中,菌种的复配比也会对酶活力产生影响[53]。综上所述,针对不同的生产要求以及所用蛋白酶的特点筛选关键因素并进行调控,可使蛋白酶活力达到最佳状态。

4.2 通过人工改造进行酶活力的调控

除可以通过改变外部环境条件,也可以通过改变蛋白酶自身结构对工程菌蛋白酶活力进行调控。蛋白酶常见的改造方法如表3所示。

表3 蛋白酶改造方法Table 3 Protease modification method

近年来,基因工程和蛋白质工程发展迅速,相关研究日益深入,这两项技术也越来越多的用于酶的改造中。基于蛋白酶的结构特征,利用基因工程和蛋白质工程,定向改变蛋白酶不同位置的氨基酸残基,提高蛋白酶的抗氧化性,热稳定性和催化活性,相关的研究结果见表4。

表4 蛋白酶的氨基酸残基变化及结果Table 4 Changes in amino acid residues of proteases and their results

由表4可见,可通过诱变引入新的氨基酸残基或根据蛋白酶自身极性需要进行氨基酸残基的更换以达到改造蛋白酶的目的。在蛋白酶分子中引入二硫键是提高蛋白酶热稳定性的方法之一,通过定点诱变,引入两个半胱氨酸可使蛋白酶分子形成二硫键,可提高其热稳定性[52]。除了形成二硫键之外,可以增加Loop区的柔韧性,提高酶与底物的结合能力进而提高酶的催化活性[54]。改变蛋白酶的氨基酸可以改变其带电性或等电点,进而改变底物与蛋白酶之间的亲和性、提高蛋白酶的催化活性[55-57]。

也可以通过在不同菌种之间进行基因克隆进行蛋白酶活力的提高。将优化后的枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(serine alkaline protease)基因克隆到酿酒酵母表达载体pY-ES2上,在酿酒酵母Whu2d中进行表达,酿酒酵母中酶的活力提高了55.2%[62]。

由上述可知,氨基酸残基的改变是在原有蛋白酶的基础之上对其进行改造,实现改善蛋白酶性质和活力的目的,而基因克隆是将基因在不同生物体中进行表达以提高蛋白酶的相关性质,两者均为当下比较常用的蛋白酶活力的改造方式。

5 微生物蛋白酶的应用

蛋白酶的首次大规模应用出现在洗涤剂行业,洗涤剂蛋白酶占到全球酶销量的90%[63]。而目前蛋白酶的应用已经进入到各个行业,食品、化学品、药品等行业都开始使用蛋白酶进行产品的生产和性能改良[64]。微生物以其更广泛的生物多样性、更多的遗传操作可能性以及操作技术的优势,日渐成为蛋白酶的主要生产者,受到越来越多行业的青睐[65]。工业中洗涤剂的制造[66-68],纺织品[69]、皮革[70]的软化,高温灭菌乳的去稳定化[71];农业上农田杂草的去除[72],土壤质量的检测[73];医学上新抗生素的研发[74-75],保健品大豆肽的提取[76]等,都有微生物蛋白酶的应用。

除微生物蛋白酶的传统利用方式以外,研究人员还以微生物实验为基础结合基因工程和酶工程,突破物种的界线,研发出新的微生物蛋白酶或用利用诱变技术进行蛋白酶的性质改良。如将昆虫产丝氨酸蛋白酶的基因在大肠杆菌中成功表达,产生了新的微生物丝氨酸蛋白酶,可在生物研究和食品加工中进行应用[77]。通过对芽孢杆菌的基因进行定向诱变,将某些基因中的胞嘧啶变为胸腺嘧啶或腺嘌呤变为鸟嘌呤,提高了其所产碱性丝氨酸蛋白酶在低温下的稳定性[78],使其在工业生产中得到广泛应用。传统的微生物蛋白酶行业在与当下新技术的结合之后展现出强劲的发展活力。

微生物蛋白酶极大地提高了产品质量和安全性能,同时也节省了大量的人力和物力。但目前蛋白酶的应用也出现了不规范的情况,如耐高温的微生物蛋白酶若在洗衣液中添加过多,在使用过后未失活,可能会通过皮肤接触,引起过敏反应,对人体造成危害[65]。

6 展望

针对微生物蛋白酶的研究随着科学技术的发展日益深入,新的微生物源和蛋白酶也得到了不断的开发和利用。对蛋白酶的研究也已不再局限于工业生成和应用的层面,而是开始向对蛋白酶结构、基因的改造和酶活力的提升方向发展。不断寻找新的蛋白酶微生物源,开发新的微生物源蛋白酶,继续深入研究阐明蛋白酶结构和功能的关系,获得活力更高、稳定性更强的高品质蛋白酶,才能为其在各行业中的应用打下坚实的基础,促进生物加工产业尤其是蛋白质生物加工产业的高速发展。