徐一鸣,郭秀兰,李秋霞,李俊锋,唐仁勇,邹 强,杜小刚

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106; 2.四川农业大学生命科学学院,四川雅安 625014)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)系芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL.)植物,其果实是我国特别是西南地区的特色调味品,以味麻著称,具有降血脂[1]、抗氧化[2]、抑菌抗虫[3]等保健功能。花椒在全国各地都有栽种,而其中又以汉源花椒较为出名,汉源花椒是我国雅安市汉源县特产,与其他花椒相比具有色泽鲜艳和麻味浓厚等特点。从唐代开始,汉源花椒就是朝廷贡品,因此又被称为贡椒[4]。汉源花椒产量高,主要产品为花椒粉、花椒油等调味料。花椒内含有挥发油[5]、总黄酮、总多酚[6]等多种活性成分,其中的黄酮是一类具有2-苯基色原酮(2-phenyl-chromones)结构的多酚类化合物,具有抗氧化、抗肿瘤[7]等生物活性。

自由基是一类具有不成对电子的原子或基团,具有很高的氧化活性,很容易与其他物质发生化学反应。适量自由基可以促进胶原蛋白和凝血酶原的合成并提高人体免疫力;而过量的自由基会破坏细胞膜的结构功能和引起基因损伤并导致变异[8],甚至引发心血管疾病、癌症、炎症和糖尿病等疾病[9-10]。因此,有效抑制自由基的氧化反应显得至关重要。合成抗氧化剂具有潜在毒副作用[11],目前研究热点主要集中在具有抗氧化活性的天然产物。已有研究表明花椒叶的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性[12],但是关于汉源花椒抗氧化性方面的研究还鲜有报道。

癌细胞是由正常细胞的原癌基因与抑癌基因发生突变产生的,具有可以无限增殖、易转化和易转移的特点,这也是恶性肿瘤形成的原因。化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的主要手段,但对正常细胞有强烈的副作用;而近年来天然产物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到人们的关注。研究发现黄酮可以抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞分裂周期和抑制肿瘤新生血管形成,具有良好的抗肿瘤活性[13],是一类良好的可用作癌症治疗的天然产物资源。但是目前还没有关于花椒黄酮抗肿瘤细胞增殖方面的研究。

因此,本实验以汉源花椒总黄酮提取物为实验材料,通过DPPH自由基、·OH清除等实验评价总黄酮提取物的体外抗氧化能力,并以不同浓度提取物处理Hela细胞,研究对Hela细胞的抗增殖作用,以期为汉源花椒功能性产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

汉源花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim) 产地为四川汉源;Hela细胞 中科院上海生科院细胞资源中心;芦丁标准品(HPLC≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;CCK-8试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司;碘化丙啶(PI) 凯基生物科技发展有限公司;EGFP-Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒 广州易锦生物技术有限公司;二甲基亚砜(DMSO) 北京索莱宝科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京索莱宝科技有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

KQ3200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司;RE52CS-1旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;BIOMATE 3S 分光光度计 美国Thermo公司;Forma Steri-Cycle CO2培养箱 美国Thermo公司;Synergy HT酶标仪 美国BIO-TEK公司;Sorvall ST 16R离心机 美国Thermo公司;Accuri C6流式细胞仪 美国贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 汉源花椒总黄酮的提取 参考杨立琛等[14]和李谷才等[15]方法,并做出一定改进。称取2 g的花椒粉末,加到35 mL石油醚中,常温,150 W密封超声30 min,抽滤后留粉末烘干并转移到三角瓶中,然后加入20%乙醇80 mL,65 ℃,150 W密封超声2 h,抽滤取大孔树脂。加入60%乙醇80 mL，常温振荡4 h(120 r/min)抽滤留滤液,再加入10 g预处理后的D101-大孔吸附树脂(蒸馏水浸泡24 h,反复冲洗至无浑浊;4%NaOH浸泡12 h,蒸馏水洗至中性;4%HCl浸泡12 h，蒸馏水洗至中性;95%乙醇浸泡3 h,蒸馏水洗至无醇味)常温振荡4 h(120 r/min),抽滤后取大孔树脂，加入60%乙醇80 mL，常温振荡4 h(120 r/min)抽滤留滤液。再将滤液进行50 ℃旋蒸,当滤液浑浊且无酒精蒸出后停止旋蒸,最后滤液在-80 ℃冰箱过夜后使用冻干机冻干。

1.2.2 黄酮得率测定 参考宋倩等[16]方法,称取10 mg芦丁标准品溶于50 mL容量瓶中,用60%乙醇定容得到质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液。分别取芦丁标准液加到10 mL容量瓶中(0、1、2、3、4、5 mL),加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,反应6 min,然后加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液,反应6 min,最后加入4 mL 4% NaOH溶液4 mL,用30%乙醇定容后摇匀,显色15 min。在510 nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,芦丁标准品质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,建立方程为y=6.39x-0.0112,R2=0.9995,y为吸光度,x为黄酮质量浓度mg/mL。

提取黄酮得率的测定:称取10 mg冻干得到的总黄酮提取物溶于10 mL 30%乙醇配制样品液,取1 mL样品液按上述方法测定吸光度,黄酮浓度使用上述方程计算。黄酮得率计算按下列公式:

式中,C提为依据标准曲线算出来的黄酮提取液中黄酮质量浓度,mg/mL;V样为乙醇体积,mL;m提为冻干后总黄酮提取物总质量,mg;m花为花椒粉末质量,g;m样为称取的冻干后总黄酮提取物质量,mg。

1.2.3 汉源花椒总黄酮提取物抗氧化活性的测定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力检测 参考Amarowicz等[17]方法,使用甲醇配制总黄酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、75、100、125 μg/mL),取1 mL待测液加到1 mL,0.5 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液中,再用甲醇定容到5 mL。摇匀静置30 min。空白对照组用蒸馏水代替DPPH。在517 nm波长处测定吸光度。实验重复三次,根据下列公式计算清除率:

式中,A0为质量浓度为0的吸光度;A测为不同质量浓度下的吸光度;A空为不同质量浓度下空白对照组吸光度。

1.2.3.2 羟自由基(·OH)清除能力检测 参考范菁华等[12]方法,使用无水乙醇配制总黄酮提取物溶液和VC溶液(0、62.5、125、250、400、500 μg/mL),反应体系为1 mL待测液、1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液、1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液,混匀后37 ℃水浴1 h,空白对照组用蒸馏水代替水杨酸。在520 nm波长处测定吸光度。实验重复三次,根据下列公式计算清除率:

式中,A0质量浓度为0的吸光度;A测为不同质量浓度下的吸光度;A空为不同质量浓度下空白对照组吸光度。

1.2.3.3 还原力检测 参考高亚妮等[18]方法,使用70%乙醇配制总黄酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、100、200、400 μg/mL),取2.5 mL待测液,加到2.5 mL 10 mg/mL铁氰化钾中,50 ℃水浴20 min,然后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸,混匀后离心20 min(3000 r/min),再取2.5 mL上清液,加入蒸馏水2.5 mL和1 mg/mL FeCl30.5 mL,摇匀静置10 min。在700 nm波长处测定吸光度。实验重复三次,吸光度越大,代表还原力越强。

1.2.3.4 总抗氧化能力检测 参考Ozkan G等[19]方法,使用无水乙醇配制总黄酮提取物溶液和VC溶液(0、50、100、200、250、300 μg/mL)和磷钼试剂液(含0.6 mol/L浓硫酸、28 mmol/L磷酸钠和4 mmol/L钼酸铵),取0.4 mL待测液,加到4 mL磷钼试剂液中,摇匀后95 ℃水浴加热90 min,在695 nm波长处测定吸光度。实验重复三次,吸光度越大,代表总抗氧化能力越强。

1.2.4 汉源花椒总黄酮提取物抗增殖活性的测定

1.2.4.1 细胞培养 Hela细胞以适当浓度接种于培养瓶中,使用含10%胎牛血清,1‰青霉素链霉素混合液的1640培养基,在5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养,每两天传代一次。

1.2.4.2 细胞增殖活性检测 实验组取对数生长期的Hela细胞,按8000个细胞,75 μL/孔接种于96孔板上,空白对照组按75 μL/孔加入含血清1640培养基;使用含2‰ DMSO的无血清培养基配制药物(花椒总黄酮浓度0、50、100、200、400、800 μg/mL),接种细胞4 h后按75 μL/孔加入96孔板。在5% CO2、37 ℃培养箱中孵育12、24、48 h后,按10 μL/孔加入CCK-8溶液后再孵育1 h,然后在450 nm酶标仪下测定吸光度。实验组设置5个复孔。根据下列公式计算细胞生存率:

式中,A0为提取物质量浓度为0的吸光度;A测为不同质量浓度下的吸光度;A空为不同质量浓度下空白对照组吸光度。

1.2.4.3 细胞周期检测 参考李云坤等[20]方法,取对数生长期的Hela细胞,按3×105个细胞,1 mL/孔接种于12孔板上;使用含2‰ DMSO的无血清培养基配制药物(花椒总黄酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接种细胞6 h后按1 mL/孔加入12孔板,在5% CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液离心(300×g,5 min)收集细胞,然后用4 ℃预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗两次(800 r/min,5 min),再用预冷70%乙醇重悬细胞,4 ℃冰箱过夜,次日使用预冷PBS洗一次,最后加入500 mL PBS(含50 μg/mL PI和100 μg/mL RNA酶),4 ℃避光反应20 min。使用流式细胞仪检测,每次计数20000个细胞,实验组设置3个复孔。结果使用FLOWJO-V10软件分析。

1.2.4.4 细胞凋亡检测 取对数生长期的Hela细胞,按5×105个细胞,1 mL/孔接种于6孔板上;使用含2‰DMSO的无血清培养基配制药物(花椒总黄酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接种细胞6 h后按1 mL/孔加入6孔板,在5%CO2、37 ℃饱和湿度下孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液离心(300×g,5 min)收集细胞于5 mL流式管内,然后用4 ℃预冷的PBS洗两次,再使用100 μL 1×Annexin-binding buffer重悬细胞,接着加入5 μL EGFP AnnexinV和2 μL PI,轻轻混匀,室温避光反应15 min,最后加入400 μL 1×Annexin-binding buffer,检测前放置于冰上。使用流式细胞仪检测,每次计数20000个细胞,实验组设置3个复孔,结果使用FLOWJO-V10软件分析。

1.3 统计方法

应用GraphPad prism5统计软件进行数据分析,多组间单因素分析使用One-way ANOVA,双因素分析使用two-way ANOVA,P<0.05表示有显著差异,P<0.01表示有非常显著差异,P<0.001表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 花椒黄酮的得率

本研究采用超声波辅助溶剂进行提取,继而用大孔树脂纯化并冷冻干燥得到花椒黄酮提取物,其黄酮得率为2.19%,略高于用超声波辅助提取法提取四川花椒果实黄酮得率(2.13%)[15],说明提取方法是可行的。

2.2 花椒黄酮的抗氧化性

黄酮具有强抗氧化性的原因主要是在于其芳香环上的羟基,它们可结合并清除自由基,且清除能力与羟基的数目和位置有关[21-22]。本研究测定了总黄酮提取物对DPPH自由基和·OH的清除率,并评价了对三价铁的还原能力与诱导形成磷钼络合物的能力,从多个方面研究了总黄酮提取物的抗氧化能力。

2.2.1 黄酮提取物清除DPPH自由基能力 由图1可知,总黄酮提取物对DPPH自由基有清除效果,并且随着质量浓度增大,清除率迅速提高。在提取物质量浓度为125 μg/mL清除率最大达到84.70%,此质量浓度下VC的清除率为94.51%,总黄酮提取物与VC的IC50值分别为65.61和4.92 μg/mL。因此,在本实验质量浓度范围内,总黄酮提取物具有较好的DPPH自由基清除效果且呈剂量依赖性,清除能力弱于VC,但是强于黄秋葵黄酮与氯仿萃取的铁皮石斛黄酮[23-24],它们的IC50值分别为2980.00和394.62 μg/mL。

图1 总黄酮提取物对DPPH自由基清除效果Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids extracts on DPPH·

2.2.2 总黄酮提取物清除·OH能力 由图2可知,总黄酮提取物有清除·OH的能力,并且随着质量浓度增大,清除能力逐渐增强;在质量浓度为500 μg/mL时清除率最大达到83.61%,此质量浓度下VC的清除率为84.07%,VC和总黄酮提取物的IC50值分别为189.80、194.40 μg/mL。因此,在本实验质量浓度范围内,总黄酮提取物对·OH有一定清除能力,并呈剂量依赖性,其清除能力和VC相比无较明显差异,但是强于黄秋葵黄酮与氯仿萃取的铁皮石斛黄酮,IC50值分别为6000.00和1589.03 μg/mL[24-25]。

图2 总黄酮提取物对·OH清除效果Fig.2 Scavenging effects of total flavonoids extracts on ·OH

2.2.3 总黄酮提取物还原力 由图3可知,总黄酮提取物具有还原力,并且随着质量浓度增大,吸光度呈上升趋势且接近线性,即还原能力不断增强。在提取物质量浓度为400 μg/mL时,吸光度为0.70,而此质量浓度下VC的吸光度为1.48。因此,在本实验质量浓度范围内,总黄酮提取物具有一定的还原力且呈剂量依赖性,虽然其还原力不如VC,但大于碱蓬黄酮(25～50) mg/mL[25]。

图3 总黄酮提取物还原力Fig.3 Reducing power of total flavonoids extracts

2.2.4 总黄酮提取物总抗氧化活性 由图4可知,总黄酮提取物具有总抗氧化能力,并且随着质量浓度增大,吸光度缓慢增长,即抗氧化活性缓慢提高。当提取物质量浓度为300 μg/mL时,吸光度达到最大值0.48;而此质量浓度下VC吸光度为1.54。因此,在本实验质量浓度范围内,总黄酮提取物有一定的抗氧化能力,且呈剂量依赖性,在质量浓度为300 μg/mL时总抗氧化能力高于该质量浓度下的茼蒿叶总黄酮[26],但远弱于VC。

图4 总黄酮提取物总抗氧化能力Fig.4 Total anti-oxidative power of total flavonoids extracts

总的来说,汉源花椒总黄酮提取物具有抗氧化活性,虽然抗氧化活性不如VC,但是DPPH自由基与·OH清除率的IC50值小于黄秋葵黄酮和铁皮石斛黄酮,相同质量浓度下的还原力强于碱蓬黄酮,总抗氧化能力强于茼蒿叶黄酮,说明汉源花椒具有良好的抗氧化活性,是一种有开发价值的植物资源。

2.3 总黄酮提取物对Hela细胞增殖的影响

由图5可知,总黄酮提取物引起细胞生存能力下降,并且随着提取物质量浓度提高,细胞生存能力在逐渐下降;与相同处理时间的对照组相比,用200～800 μg/mL总黄酮提取物处理12 h后极显著降低了Hela细胞的生存能力(P<0.001);用50 μg/mL处理24 h后显著降低了Hela细胞的生存能力(P<0.01);100～800 μg/mL处理24 h极显著地降低了Hela细胞的生存能力(P<0.001);用50～800 μg/mL处理48 h后极显著地降低了Hela细胞的生存能力(P<0.001)。且生存能力随黄酮浓度的增加而降低,在800 μg/mL时不同处理时间的细胞生存率达都到最低,12、24和48 h分别为27.15%、10.43%和30.63%;IC50值分别为454.3、271.1和361.9 μg/mL。因此,在本实验质量浓度范围内,总黄酮提取物能显著抑制Hela细胞增殖,且呈剂量依赖性;但可能是因为细胞的适应能力,提取物长时间处理后对细胞增殖的抑制效果减弱,因此在后续实验中,选择提取物抑制效果最好的处理时间24 h进行后续实验。

图5 不同质量浓度下Hela细胞的生存能力Fig.5 Viabilities of Hela cells at various mass concentrations注:**表示相同处理时间的实验组与对照组相比差异 非常显著(P<0.01);***表示相同处理时间的实验组 与对照组相比差异极显著(P<0.001);图6～图8同。

2.4 总黄酮提取物对Hela细胞周期的影响

细胞周期阻滞是指正常细胞受到外来因子的刺激后,周期调控蛋白的异常表达导致细胞无法进行正常有丝分裂,从而引起细胞增殖抑制。由图6可知,总黄酮提取物使细胞周期阻滞在G2/M期。对照组细胞培养24 h后处于各周期细胞数量所占比例分别为:G0/G1期57.76%,S期27.23%和G2/M期22.49%;在最高质量浓度下G0/G1期细胞数量所占比例极显著下降到40.85%(P<0.001),S期为28.7%,无明显变化,而G2/M期极显著上升到40.01%(P<0.001)。这与前人结果类似,研究表明植物黄酮类物质有阻滞癌细胞分裂的作用:木犀草素-7-O-葡萄糖苷通过上调JNK信号通路引起人肝癌HepG2细胞的G2/M期阻滞[27]、黄芪总黄酮和毛蕊异黄酮通过下调G1/S-特异性周期蛋白D1的表达使K562人慢性髓系白血病细胞的G0/G1期细胞增多[28]。因此,在本实验质量浓度范围内,高质量浓度的总黄酮提取物会扰乱Hela细胞正常周期,使其阻滞在G2/M期,干扰了细胞正常有丝分裂的进行

图6 不同质量浓度下细胞周期分布比例Fig.6 Proportion of the cell cycle distribution at various mass concentrations

。

2.5 总黄酮提取物对Hela细胞凋亡的影响

细胞凋亡又称细胞自杀,是细胞为了维护内环境的稳态主动进行的程序性死亡,受一系列基因的调控,这也是抑制细胞增殖的原因之一。由图7、图8可知,总黄酮提取物会诱导细胞凋亡,并且随着药物质量浓度上升,细胞凋亡率逐渐升高。对照组细胞药物处理24 h后的早期凋亡率(LR)为4.25%,晚期凋亡率(UR)为12.18%,早期和晚期凋亡率都随黄酮提取物浓度的增加而逐渐提高,当800 μg/mL浓度处理24 h后早期凋亡率达到15%,晚期凋亡率达到74.3%,极显著高于对照组(P<0.001),且镜下观察发现有明显的凋亡小体。这与前人结果相似:槲皮素可以通过上调AMPK/p38信号通路诱导HT-29 结肠癌细胞凋亡[29]。因此总黄酮提取物会诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性,这很可能是提取物引起细胞增殖抑制的原因。

图7 总黄酮提取物对Hela细胞凋亡影响Fig.7 Effect of total flavonoids extracts on the apoptosis of Hela cells

图8 不同质量浓度下细胞凋亡率Fig.8 Cell apoptosis rates at various mass concentrations

3 结论

本研究采用超声波辅助提取结合大孔树脂纯化的方法制备了汉源花椒黄酮,并研究其抗氧化活性及对人宫颈癌Hela细胞的增殖和细胞周期的影响。结果表明,汉源花椒总黄酮提取物具有较强的DPPH和羟自由基的清除能力,同时具备一定的还原力与总抗氧化能力;肿瘤细胞实验中发现汉源花椒黄酮在800 μg/mL处理24 h可最大限度地降低Hela细胞生存率,这可能与该浓度提取物处理24 h的细胞发生G2/M期阻滞和细胞凋亡率升高有关。这些结果说明汉源花椒黄酮具有良好的抗氧化活性,且具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,是一种具有开发价值的植物资源。