刘诗瑶,吴文林,肖全伟,梁恒兴,苟兴华

(1.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106; 2.成都市食品药品检验研究院,四川成都 610100)

回收油脂又称地沟油、老油、潲水油,主要是指剩饭、剩菜(通称泔水)收集后的上层浮油[1]。近年来,我国报道了多起“地沟油事件”,引起了社会各界的关注。2015年《食品安全法》中明确规定“禁止生产经营用回收食品作为原料生产的食品”[2],但回收油脂成本低廉,监管难度大,使得不法商家有机可乘,导致回收油脂回流餐桌、流入食品生产中的现象屡禁不止,严重危害人民群众的健康。为此,2017年6月,原国家食药监总局办公厅公开征集“地沟油”补充检验方法,2018年2月发布了BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》补充检验方法,但该方法需用标准品作为对照,且存在检测成本高、效率较低、假阳性率高等缺点。因此,建立一种快速、可靠的食用油脂中非法添加回收油脂的筛查确证和定量方法是当务之急。

辣椒是我国含油餐饮食品如中餐、火锅等普遍使用的香辛调味料,辣椒素类化合物是其主要呈味物质[3]。这类物质脂溶性强、耐高温,性质极为稳定,目前的废弃油脂处理工艺如水洗、脱胶、脱色、脱酸、除臭、精滤等并不能完全去除[4]。因此,如食用油脂中检出含有辣椒素,则可以判定该油脂使用或非法添加了回收油脂。

目前已见报道检测辣椒素的方法主要有液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-10]等。液相色谱法灵敏度较低、假阳性率高,难以定性。以液相色谱-串联质谱法为代表的低分辨质谱法,同样存在选择性差、定性能力弱、假阳性率高等缺点[11]。超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap mass spectrometry,UHPLC-Q/Orbitrap)是最新的高分辨质谱技术,其分辨率高达280000,且具有质量精度高,对前处理净化能力要求低,假阳性率低等优势。其不仅可以在无标准物质情况下进行高通量的快速筛查和确证,还可在有标准物质情况下进行高灵敏度的定量分析[12]。Orbitrap目前已广泛应用于食品添加剂[13-15]、农药残留[16-19]、兽药残留[20-22]、真菌毒素[23-25]等的筛查、确证和定量。目前尚未见用Orbitrap技术分析食用油脂中辣椒素的报道。

本文首次构建了UHPLC-Q/Orbitrap快速筛查和定量检测食用油脂中天然辣椒素、合成辣椒素和二氢辣椒素的方法。该方法通过建立3种辣椒素的高分辨质谱信息数据,可在无标准物质的情况下利用一级精确质量数和二级碎片精确质量数进行快速筛查,同时可在有标准物质的情况下对的阳性样品进行定量分析;最后通过实际阳性样品检测,验证方法的可靠性。本方法为食用油脂中非法添加回收油脂行为的筛查确证和准确定量检测提供了新的技术和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

20组食用油样品 均购自成都本地超市;2组精炼回收食用油脂 由实验室模拟工厂工艺自制,样品详细信息见表1;甲醇和乙腈(质谱级) 德国Merck公司;二氯甲烷(色谱纯) 德国Merck公司;甲酸(质谱级) 美国Sigma-Aldrich公司;浓硫酸和氢氧化钠(分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(6 cc,500 mg) 美国Waters公司;一次性滤膜(0.22 μm PTFE) 美国Agilent公司;天然辣椒素(Capsaicin,纯度99.0%)、合成辣椒素(Nonivamide,纯度99.0%)、二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin,纯度99.0%)等3种标准品 均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

表1 样品信息Table 1 Information of samples

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱仪(包括Vanquish超高效液相色谱仪和Q Exactive Plus四极杆/静电场轨道阱质谱仪,配有HESI可加热电喷雾离子源及Trace Finder 4.1数据采集分析系统) 美国Thermo Fisher公司;MS105DU十万分之一天平 瑞士Mettler-Toledo公司;ME203万分之一天平 瑞士Mettler-Toledo公司;Lab Dancer涡旋混合器 德国IKA公司;Milli-Q纯水机 美国Millipore公司;N-EVAP-24位氮吹仪 美国Organomation公司;TGL-16M台式冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;超声波清洗机 湖北鼎泰恒胜科技设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准储备液的配制 分别称取适量天然辣椒素、合成辣椒素和二氢辣椒素标准品,以甲醇为溶剂,分别配制成质量浓度为1 mg/L的标准储备液。将3种辣椒素的标准储备液用甲醇配制成质量浓度为0.1 mg/L的混合标准储备液,于4 ℃冰箱中避光保存。将上述混合标准储备液用甲醇逐级稀释成质量浓度为0.1、1、5、10、20、50和100 μg/L的标准工作溶液,现用现配。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 提取 准确称取油样1 g(精确至0.1 mg)于10 mL离心管中,加入1 mL二氯甲烷,再加入3 mL 2%氢氧化钠溶液,涡旋3 min,超声3 min,10000 r/min离心10 min,取上层水相;残留有机相再加入3 mL 2%氢氧化钠溶液同法操作,合并水相,再用稀硫酸(1+15)溶液调节pH至2～3之间,待净化。

1.2.2.2 净化 将水相提取液直接加载到6 mL规格Oasis PRiME HLB固相萃取柱,无需活化和平衡,保持每秒1～2滴的流速,收集洗脱液,40 ℃氮气吹至近干,残渣用1.0 mL甲醇定容,过0.22 μm PTFE滤膜,上机分析测定。

1.2.2.3 基质标准溶液的配制 取食用油脂阴性样品,按1.2.2节前处理浓缩至近干后,加入1.0 mL质量浓度为0.1、1、5、10、20、50和100 μg/L的混合标准溶液复溶,涡旋混匀,过0.22 μm PTFE滤膜,上机分析。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱:Thermo Scientific Accucore Vanquish C18+色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.5 μm);柱温:40 ℃;流动相:A为0.1%甲酸水,B为0.1%甲酸乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:0～1 min,15% B;1～2 min,90% B;2～4 min,90% B;4～4.1 min,15% B;4.1～5 min,15% B。进样量:2 μL。

1.2.3.2 质谱条件 离子源:HESI源;喷雾电压:3.5 kV;离子传输管温度:320 ℃;鞘气(N2)流速:35 arb;辅助气(N2)流速:10 arb;吹扫气(N2)流速:0 arb;加热器温度:350 ℃;S-len:60。扫描模式:正离子模式;采集方式:全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2);扫描范围:100～400 m/z;分辨率:一级70000,二级17500;归一化碰撞能:20%、40%和60%;AGC target:一级1 e6、二级2 e5;最大注入时间:一级100 ms、二级50 ms;循环数:3;MSX数:1;隔离宽度:1.5 m/z;动态排除:5 s。3种辣椒素的其他质谱参数见表2。

表2 3种辣椒素的其他质谱参数Table 2 Other mass spectrometry conditions of the 3 kinds of capsaicinoid

1.2.4 基质效应计算 本实验采用相对响应值法消除基质效应。基质效应采用以下公式计算:

式中:A和B分别为3种辣椒素混和标准物质在基质匹配标准溶液和纯溶剂(本实验中为纯甲醇)中的仪器响应值。基质效应为正表示基质增强效应,为负表示基质抑制效应。

1.3 数据处理

采用美国Thermo Fisher的Tracefinder 4.1和Xcalibur 4.2软件进行分析,Originpro 2018制图。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱选择

近年来,固相萃取技术被广泛应用于食品的前处理净化,其具有操作方便、溶剂消耗低、特异性强、回收率高的优点[26-28]。本实验比较了Waters PRiME HLB、Agilent EMR-Lipid和Agela Cleanert S C18三种固相萃取小柱的净化效果。结果显示,三种固相萃取小柱的回收率均大于90%,如图1。但考虑到C18小柱除油脂效果差,EMR-Lipid前处理操作相对繁琐,最终选用PRiME HLB固相萃取小柱进行样品净化。

图1 固相萃取柱对提取回收率的影响Fig.1 Effects of different solid-phase extraction column on the recovery rate

2.2 质谱条件的优化

配制质量浓度为50 μg/L的3种辣椒素混合标准溶液,利用UHPLC-Q/Orbitrap对混合标准物进行Full MS/dd-MS2方式全扫描,得到一级全扫描质谱图,以各化合物的分子离子峰理论精确质量数提取色谱图,确定目标物为[M+H]+的准分子离子峰。3种辣椒素的相对质量标准偏差小于0.005‰,符合高分辨质谱要求。在进行一级全扫描的同时,采用数据依赖性二级扫描,通过二级谱图进行进一步定性。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。3种辣椒素的母离子、碎片离子等信息见表2。

2.3 色谱条件的优化

3种辣椒素均为弱极性化合物,在C18色谱柱上均有较好的保留。采用Thermo Accucore Vanquish C18+(100 mm×2.1 mm,1.5 μm)分离3种辣椒素,5 min内完成分析。发现其对三种辣椒素保留均较好,目标峰响应高,峰形尖锐且对称。这可能是因为Accucore Vanquish色谱柱的1.5 μm的实心核颗粒带来了更好的柱效。因此后续实验选用Thermo Accucore Vanquish C18+(100 mm×2.1 mm,1.5 μm)分离。

取阴性食用油脂样品,按1.2.2节前处理方法浓缩至近干后,加入1.0 mL质量浓度为50 μg/L混合标准溶液,分别以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈和水-乙腈作流动相,结果显示,以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作为流动相,基线噪音最低,峰型和灵敏度最佳。因此本实验最终选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作为流动相,采用梯度洗脱分离。加标食用油脂基质溶液中3种辣椒素(50 μg/L)的提取离子流色谱图见图2。

图2 加标食用油脂基质溶液中3种辣椒素(50 μg/L)的提取离子流色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of the 3 kinds of capsaicinoid(50 μg/L)spiked in the edible oil matrix solution

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 选取不同基质的空白食用油脂样品,按照1.2.2进行样品前处理,提取空白基质分别配制0.1、1、5、10、20和40 μg/L不同质量浓度的混合标准工作溶液,上机检测,绘制基质标准曲线,结果见表3。结果显示,3种辣椒素在各自的范围内线性关系良好,决定系数R2≥0.999。

表3 3种辣椒素的线性范围、线性方程、决定系数、基质效应、检出限和定量限(n=6)Table 3 Linear ranges,linear equations,determination coefficients,matrix effects,LODs and LOQs of the 3 kinds of capsaicinoid(n=6)

2.4.2 基质效应考察 本实验选择响应值法进行基质效应的考察。结果发现,三种辣椒素的基质效应均较小(表3)。但考虑到食用油脂掺入回收油脂后基质变复杂,因此本实验中依旧采用基质匹配标准溶液,外标法定量。

2.4.3 检出限和定量限 本实验采用美国国家环境保护局(EPA)推荐方法确定方法的检出限。以飞行时间质谱、静电场轨道阱质谱为代表的高分辨质谱依靠提取精确质量数来进行定量,但其色谱图的噪声几乎可以忽略不计[29]。本实验采用空白基质做低浓度加标回收实验,重复进样6次,根据结果的标准偏差确定检出限和定量限。结果表明,天然辣椒素、合成辣椒素和二氢辣椒素的方法检出限分别为0.02、0.05和0.02 μg/kg,方法定量限分别为0.1、0.2和0.1 μg/kg(见表3)。

2.4.4 回收率和精密度 为验证方法的准确度,选取有代表性的空白食用油脂基质(6号样品调和油)进行3个水平的加标回收试验,平行测定6次,加标回收率及RSD结果见表4。从表4可以看出,3种辣椒素的平均回收率均在66.7%～112.8%范围内,RSD为3.2%～9.7%,均小于10%。

表4 在3个加标水平下的回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions at three spiked levels(n=6)

2.5 方法适用性和实际样品检测

选取20组食用油脂和2组精炼废弃食用油脂样品对上述构建的检测方法进行验证。结果表明,市场购买的菜籽油等食用油脂均未检出三种辣椒素,而实验室自制的2组精炼废弃食用油脂(阳性样品)均检出三种辣椒素,其中21号样品天然辣椒素、合成辣椒素和二氢辣椒素的含量分别为0.0035、0.0003和0.0036 μg/kg,22号样品为0.003、0.0002和0.0029 μg/kg,结果也印证了回收食用油脂的回收精炼工艺并不能完全去除掉这三种辣椒素。由此可见,该方法可以快速筛查食用油脂是否掺杂了回收食用油脂,并可进行准确的定量检测。

3 结论

本文通过对仪器条件和样品前处理的优化,首次建立了UHPLC-Q/Orbitrap快速筛查食用油脂中3种辣椒素的分析方法。其平均回收率在66.7%～112.8%范围内,相对标准偏差在3.2%～9.7%范围内;检出限在0.02～0.05 μg/kg之间,定量限在0.1～0.2 μg/kg之间。该方法通过Orbitrap技术建立了3种辣椒素高分辨质谱信息数据,适用于在无标准物质的情况下,运用快速的前处理方法可对大批量食用油样品中3种辣椒素进行快速筛查及确证,且可在有标准物质的情况下进行高灵敏度的定量分析。本方法为食用油脂中非法添加回收油脂行为的筛查确证和定量检测提供了新的技术和新思路。