关尚玮,陈 恺,万红艳,刘慧丽,范利君,王雪妃,李焕荣

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

枣(ZiziphusjujubeMill)鼠李科(Rhamnaceae)木本植物。大枣中含有丰富的黄酮类、有机酸、糖类、维生素和矿物质元素等物质,有很高的保健作用和药用价值[1]。红枣除少部分鲜食外,大量被制成干枣制品进行销售[2],目前大枣的干制方式主要分为自然干制和热风干制[3],大枣热风干燥是一种高效、流行的果实保鲜和深加工方法[4]。不同的干制方式对大枣的营养价值有很大的影响。有机酸作为枣果中重要的风味指标之一,对果实的营养价值有着重要的作用[5]。大枣中的酸类物质可以起到免疫调节作用,提高大鼠的免疫应答,降低自身体内的低抗体应答[6]。大枣在不断地发育过程中,三羧酸循环(TCAC)及糖异生作用在不断地消耗有机酸,使有机酸在果实内部逐渐代谢。大枣加工制品中,有机酸的含量在不同的处理方法中逐步地发生变化,从而影响大枣的品质[7]。

目前有机酸常见的测定方法有滴定法、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)[8-12]等,其中气相色谱法不适用于不挥发性物质和对热敏感性物质,且前处理比较繁琐[13]。高效液相色谱法因高效快速、灵敏度较高、稳定性好在有机酸含量的测定与分析过程中被广泛地使用[14-17]。高效液相色谱法用于分析大枣在干制过程中有机酸的含量变化研究较少,大多集中在生长发育期间以及干制过后产品的测定[18-22]。王向红等[23]利用HPLC测定不同种类的枣果中齐墩果酸和熊果酸的含量并进行分析,发现酸枣中有机酸的含量明显高于其它大枣中的酸含量。刘祯妍等[24]使用高效液相色谱法对‘骏枣’的果实、叶片在生长过程中有机酸的变化趋势进行了探究,发现骏枣中主要以苹果酸、柠檬酸为主,果实与叶片中酸的总含量变化趋势相同。但是,关于哈密大枣中有机酸含量变化方面的研究少有报道[25-26]。基于前期实验研究基础,45 ℃热风干制[27]条件,哈密大枣有较好的果型指数与细胞结构。

本研究以脆熟全红期的哈密大枣作为实验材料,采用自然晒干与45 ℃热风干制处理,对哈密大枣干燥过程中6种有机酸的含量进行定性和定量分析,探究哈密大枣在自然晒干与热风干制过程中有机酸含量的变化规律,为哈密大枣果实品质的研究提供理论依据,从而更好地控制大枣在生产过程中产品的品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

哈密大枣 均产自新疆哈密;95%乙醇、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸等 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准品、甲醇(色谱纯)等 上海源叶生物科技有限公司;实验用水 超纯水。

HPLC(LC-20A)高效液相色谱仪 日本岛津公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海市一恒科技有限公司;Q-250DE超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司;HP-01循环水式多用真空泵 天津市恒奥科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 自然晒干:晾晒场地系乌鲁木齐新疆农业大学工科楼,平均日照12 h,晾晒期间最高温度27 ℃,最低气温7 ℃。将脆熟全红期哈密大枣30 kg平铺于凉席上,放置于天台空地进行晾晒,含水量控制在25%左右停止晾晒,在自然晒干过程中每隔2 d取一次样,每次取样250 g,测定大枣中有机酸的含量。

热风干制:干燥箱升温至45 ℃时,将哈密大枣铺平放置于电热恒温鼓风干燥箱内进行热风干制,在热风干制过程中每隔4 h取一次样,每次取样250 g,当大枣的水分含量控制在25%左右时干制结束,测定项目同上。

1.2.2 有机酸测定方法的建立 色谱条件:WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)进行分离，流动相为一定浓度的KH2PO4缓冲溶液∶甲醇=9∶1；调节到一定pH；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

1.2.2.1 色谱条件的优化 检测波长的选择:分别对6种有机酸在190～400 nm进行全波长扫描,比较各有机酸在不同波长处的最大吸收峰。

流动相浓度的选择:将流速调整为0.8 mL/min,柱温30 ℃,进样量为20 μL,磷酸盐缓冲溶液的浓度分别调整为0.01、0.05、0.1 mol/L。考察不同浓度的流动相对各有机酸保留时间的影响。

流动相pH的选择:流速调整为0.8 mL/min,柱温30 ℃,进样量为20 μL,固定磷酸盐的浓度不变为0.05 mol/L,用1.0 mol/L的磷酸调节pH,考察不同pH(2.1、2.3、2.5、2.7、2.9)条件下各有机酸的分离情况。

1.2.2.2 有机酸标准溶液的制备 精确称取适量的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准品,用超纯水超声溶解,分别制成15 mg/mL的标准溶液。

1.2.2.3 有机酸标准曲线的绘制 精确吸取草酸溶液1 mL,酒石酸、柠檬酸、琥珀酸溶液各10 mL,苹果酸溶液1 mL,富马酸溶液1 mL,加入超纯水配制成草酸溶液0.5 mg/mL、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸溶液1 mg/mL、苹果酸溶液3 mg/mL、富马酸0.1 mg/mL的有机酸混合标准品溶液,分别过0.22 μm微孔滤膜待测。连续6次进样,并进行测定。以有机酸混合标准品溶液的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,对结果进行线性回归分析,得到标准曲线。

1.2.2.4 样品处理 参照张丽丽等[28-30]的方法并进行改进,准确称量枣果5.00 g,加入适量超纯水,置于预冷的研钵内,将研钵放置于冰块上研磨至匀浆,使用15 mL超纯水进行多次冲洗研钵并转至25 mL离心管中,超声提取20 min后,将离心管转至4 ℃ 15000 r/min离心20 min,过滤,收集滤液,采用超纯水定容至10 mL容量瓶中,通过0.22 μm滤膜过滤后,置于样品瓶中进行上机测定。

1.3 数据处理

在Lab Solution工作站,色谱图中各峰的峰面积与其保留时间对得到的物质进行定量与定性分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择 分别对6种有机酸在190～400 nm进行全波长扫描,发现各种有机酸在210 nm波长处均有较大的吸收峰,故采用210 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相浓度的选择 磷酸盐缓冲液浓度的高低影响酸存在形式的稳定性,从而影响分离效果。将流动相配制成不同浓度的溶液,研究流动相浓度对各酸保留时间的影响。结果见图1。由图1可知,当流动相的浓度为0.05 mol/L时,各物质的分离度较好。随着流动相浓度的继续增加,其分离效果稍有增强。但由于高浓度的盐会对泵和柱子的寿命产生影响,因此选择0.05 mol/L的KH2PO4溶液进行后续实验。

图1 流动相浓度对保留时间的影响Fig.1 Effect of mobile phase concentration on retention time

2.1.3 流动相pH的选择 通过调节流动相的pH,可以达到抑制有机酸在水溶液中解离的作用。将流动相调成不同pH,按照同样的色谱条件,得到流动相pH对有机酸保留时间的影响,结果见图2。由图2可知,改变流动相的pH对草酸以及苹果酸的保留时间影响最大,但pH的降低会增加色谱柱的损伤,当流动相的pH为2.3时,各物质的保留时间以及分离度较好,所以选用流动相的pH为2.3进行后续实验。

图2 流动相pH对保留时间的影响Fig.2 Effect of mobile phase pH on retention time

2.2 有机酸标准曲线的建立

由表1可知,6种有机酸在0.0005～3 mg/mL线性范围内,决定系数(R2)在0.9991～0.9996之间,表明6种有机酸的相关性良好,检出限范围在0.0002～0.0005 mg/mL之间,定量限范围在0.0008～0.0098 mg/mL,在此条件下可测定大枣中的有机酸含量。

表1 有机酸标准曲线的线性参数Table 1 Linear parameters of standard curve of organic acid

2.3 HPLC图谱分析

有机酸混合标准品的高效液相色谱图见图3。从图3得出,6种有机酸标准品达到基线分离。精确吸取哈密大枣溶液20 μL进样,结果见图4。图4表明,哈密大枣溶液中含有5种有机酸,且分离度较好,琥珀酸未检出。

图3 有机酸混标准品的高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatography of organic acid mixed reference

图4 哈密大枣有机酸高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatography of organic acids in hami jujube

2.4 精密度检测结果

准确吸取稀释后的有机酸标准溶液20 μL,连续进样6次,分别计算其精密度。由表2可知,各混合标准溶液的相对标准偏差(RSD)在0.99%～4.00%之间,表明该方法的精密度达到分析要求。

表2 测定方法的精密度Table 2 Precision of the method

2.5 重复性试验结果

精密称取哈密大枣样品6份,按1.2.2.4方法制备样品溶液,按照上述色谱条件进样20 μL,重复进样6次,并计算其相对标准偏差。由表3得出,6次实验的RSD均在0.45%～4.11%之间,表明该方法重现性良好。

表3 测定方法的重复性Table 3 Repeatability of the method

2.6 回收率结果

准确称取哈密大枣5.0 g,按照按1.2.2.4方法制备样品提取液,准备同一样品提取液6份,将不同质量浓度的各种有机酸标样加入至每份提取液中,充分混匀后,经0.22 μm滤膜过滤后进样检测,平行测定6次,根据加入的标准品质量浓度与检出的质量浓度计算回收率,结果见表4。由表4可知,各有机酸的回收率在95.96%～104.35%范围之间,说明此方法在测定过程中的回收率良好,精确度较高。

表4 有机酸加标回收率Table 4 Standard recovery rate of organic acids

2.7 哈密大枣有机酸含量测定结果

由图5得出,自然晒干整个过程中,5种有机酸含量呈先下降后上升的趋势,且在干制初期变化明显,琥珀酸未检出。

图5 自然晒干过程中有机酸含量变化Fig.5 Changes of organic acid content in natural drying process注:不同字母表示差异显著(P<0.05);图6同。

在干制初期,随着干制时间的延长,大枣中的有机酸参与三羧酸循环的量逐渐增加,有机酸在不断的代谢过程中逐渐转变为糖,致使酸含量不断降低。其中苹果酸的含量在第4 d降至最低值,为(7.58±0.05) mg/g,且差异显著(P<0.05),富马酸含量在第6 d含量降至最低,为(0.02±0.03) mg/g,差异显著(P<0.05)。随着干制时间的延长,大枣的呼吸作用不断减弱,有机酸开始快速积累[31]。其中草酸在干制第10 d达到(0.14±0.08) mg/g,苹果酸、柠檬酸、富马酸在干制第12 d分别达到(10.15±0.19)、(1.38±0.01)、(0.33±0.08) mg/g。上升幅度从大到小依次为苹果酸>酒石酸>柠檬酸>富马酸>草酸,至干制结束第12 d时,草酸与酒石酸含量分别降至(0.08±0.09)、(3.72±0.28) mg/g。

由图6可知,在整个热风干制过程中,随着干制时间的延长,45 ℃热风干制条件下,总有机酸含量呈现先降低后升高的趋势,且在干制结束时,干枣中有机酸含量明显高于鲜枣,这可能与相关代谢酶活性和热胁迫的影响有关。在干制初期,苹果酸含量相对较高,在第12 h酸含量降至最低,为(6.62±0.58) mg/g、酒石酸在第12 h含量降至最低,为(3.02±0.09) mg/g。可能是因为随着热风干制时间的不断延长,导致呼吸作用停止以及酶活性被抑制,有机酸停止消耗,致使各有机酸含量相对升高。草酸在干制第12 h酸含量降至最低,在第52 h含量升至最高。至干制结束第96 h,草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸含量分别为(0.21±0.01)、(5.32±0.29)、(10.41±0.34)、(0.98±0.03)、(0.31±0.13) mg/g。

图6 45 ℃干制过程中有机酸含量变化规律Fig.6 The variation rule of organic acid content in dry preparation at 45 ℃

综上所述,哈密大枣在干制过程中主要以苹果酸、酒石酸、柠檬酸为主,琥珀酸未检出,表明哈密大枣属于苹果酸型果实,这与马倩倩等[32]的研究基本一致。王恒超等[33]研究了骏枣在干制过程中总酸的变化情况,随着干制时间的延长,酸含量由于呼吸作用的加强,呈下降趋势。本实验研究与其相比,具体测定了总酸中各有机酸的含量变化,趋势存在差异可能与枣果的品种、有机酸的提取方法以及有机酸含量的计算方式有关。大枣中的苹果酸与柠檬酸是三羧酸循环途中的主要中间产物,通常情况下可能不会大量的积累,然而有机酸含量的不断降低主要是在干燥过程中一部分有机酸转变为糖,一部分则氧化成CO2和H2O。而大枣中柠檬酸的积累,可能是在TCA过程中,上游阶段柠檬酸的合成比较活跃,而下游阶段的分解环节受抑制等原因造成的[34]。干燥过程中,苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸(SDH)的活性变化,均对苹果酸的积累和降解有显著影响[35]。45 ℃热风干制和自然晒干相比,在干制结束时,苹果酸、柠檬酸的含量无明显差异(P>0.05)。其中自然晒干在12 d时结束干制,45 ℃热风干制在96 h时结束干制,由此相对较低的感知温度处理,可以缩短干制时间,又能保存大量的生理活性物质。

3 结论

本次实验建立了哈密大枣有机酸含量测定的高效液相色谱分析方法,并利用此方法测定了哈密大枣在自然晒干与45 ℃热风干制过程中5种有机酸含量的变化。研究表明,不同干制方式处理哈密大枣在干燥过程中,5种有机酸含量变化趋势呈现明显差异,琥珀酸未检出,有机酸变化由高到低的顺序依次为:苹果酸>酒石酸>柠檬酸>富马酸>草酸。各有机酸的含量以干基计算,消除了干燥过程中水分散失对有机酸的影响,更真实地反映了有机酸种类和含量的内在变化形式,从而建立了一种较高效、便捷的测定大枣中有机酸含量的方法,相较传统的有机酸检测方法灵敏度高,更加方便快捷。实验过程中未测定在干制过程中影响哈密大枣有机酸的相关酶活性变化,酶活性的高低也会影响到果实中有机酸的含量。因此,对哈密大枣在干制过程中有机酸代谢的相关酶活性的测定还有待进一步的研究。