秦晶晶,钱慧琴,赵 媛,魏琬絜,袁铁峰,魏 婧

(新乡医学院三全学院,河南新乡 453200)

柿科植物柿(Diospyroskaki)在我国被广泛种植,柿叶(Persimmon Leaves)为其干燥叶,具有活血止血、生津止渴等功效,是公认的天然保健食品。研究表明,柿叶富含黄酮、三萜类、维生素类与微量元素等多种药理活性物质[1-4],具有抗氧化、抗癌、止血、杀菌、免疫调节等作用[5-6]。作为柿叶中最主要的活性成分之一的黄酮类化合物,在抗氧化、抗菌、抗衰老和调节血压等方面具有显著功能[7-10],具有很高的营养保健价值。

目前,黄酮类化合物的提取方法主要有热水提取、有机溶剂提取、超声波和微波辅助提取以及酶解提取等[11]。Ji等[12]用正交法优化柿叶总黄酮回流提取工艺及其抗氧化研究,王兰等[13]用响应面法优化柿叶总黄酮提取工艺,但尚未有人探讨正交和响应面在确定最佳柿叶回流提取工艺中的优劣。因此为获得最佳柿叶黄酮回流提取工艺和充分开发利用柿叶中的生物活性成分[14-18],本研究以河南新乡延津县的柿叶作为研究对象,采用回流提取法在单因素实验的基础上,考察了乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间对柿叶中总黄酮提取量的影响,并分别用正交试验法和响应面法优化柿叶中总黄酮的提取工艺,找出最佳工艺的方法,并且在最佳工艺方法下对其清除DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基清除的能力进行初步研究,确定柿叶总黄酮抗氧化活性,以期为柿叶综合利用和提取柿叶总黄酮作为天然食品抗氧化剂等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柿子叶 采自河南省延津县丰庄镇秦庄村,新乡医学院药学院中药学教研室鉴定为柿科植物柿(Diospyros kaki);芦丁对照品 购自中国食品药品检定研究院(批号:100080-201408);1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 购自东京化成工业株式会社(CAS:1898-66-4);95%乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等试剂均为分析纯 购于天津市德恩化学试剂有限公司。

电子分析天平 上海象平仪器仪表有限公司;SG-4054型数控精密恒温水浴锅 上海硕光电子科技有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;R206型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司;SHZ-3型循环水式真空泵 郑州杜甫仪器厂;101-8型电热鼓风恒温干燥箱 江苏金坛市佳美仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柿叶总黄酮的提取 柿叶在60 ℃恒温干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,过40目筛,得柿叶粉;称取1.0 g柿叶粉置于圆底烧瓶中,在一定的提取温度、乙醇液料比、乙醇浓度和提取时间的条件下进行总黄酮的回流提取,然后将得到的提取液抽滤,用95%乙醇定容至25 mL容量瓶,备用。

1.2.2 总黄酮的测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品25 mg,置于50 mL容量瓶中,加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度,摇匀即得芦丁对照品溶液(0.5 mg/mL)。精密吸取芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分别置于10 mL具塞试管中,各加水至5.0 mL,分别加入5%亚硝酸钠0.6 mL,摇匀,放6 min,加入10%硝酸铝0.6 mL,摇匀后放置6 min,加入4%NaOH 3.0 mL,加水至刻度,摇匀后放置15 min。于506 nm波长处测定吸收度A[9],以芦丁浓度C(μg/mL)为横坐标,吸收度A为纵坐标,绘制标准曲线,y=0.0113x+0.0171，R2=0.9998。

1.2.2.2 柿叶总黄酮的测定 准确量取样品溶液0.3 mL于10 mL比色管中,按照1.2.2.1中所述方法进行操作,按下式计算黄酮提取量。

式中:W表示黄酮提取量,mg/g;c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度,mg/mL;D表示溶液稀释倍数;m表示药材取样量,g。

1.2.3 单因素对黄酮提取量的影响 以乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间为要素因子,研究各因素对柿叶中总黄酮提取量的影响。

1.2.3.1 乙醇浓度 按1.2.1方法,固定料液比为1∶50 (g/mL),提取温度为60 ℃,提取时间为60 min,考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)对柿叶总黄酮提取量的影响。

1.2.3.2 提取温度 在上述优化乙醇浓度的基础上,固定乙醇浓度50%,料液比为1∶50 (g/mL),提取时间为60 min,考察提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)对柿叶总黄酮提取量的影响。

1.2.3.3 料液比 在上述优化乙醇浓度和提取温度的基础上,固定乙醇浓度50%,提取温度为60 ℃,提取时间为60 min,考察料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)对柿叶总黄酮提取量的影响。

1.2.3.4 提取时间 在上述优化乙醇浓度、提取温度和料液比的基础上,固定乙醇浓度50%,提取温度为60 ℃,料液比为1∶60 (g/mL),考察提取时间(40、60、80、100、120、140 min)对柿叶总黄酮提取量的影响。

1.2.4 正交试验设计 为了获得以乙醇作为溶剂,回流提取柿子叶总黄酮的最佳工艺条件,在单因素实验结果基础上,以柿子叶总黄酮提取量为考察指标,进行 L9(34)正交试验,具体因素与水平设计见表1。

表1 L9(34)正交试验的因素与水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 响应面试验设计 在单因素实验结果基础上,按照Box-Benhnken中心组合试验设计原理,采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验。本实验以总黄酮提取量为响应值,选取乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)、提取时间(D)四因素三水平进行试验设计,因素水平见表2。

表2 因素水平编码Table 2 Code of factors and levels

1.2.6 柿叶总黄酮体外抗氧化试验

1.2.6.1 柿叶总黄酮对DPPH自由基清除活性的测定 将正交试验(乙醇浓度为40%,提取温度50 ℃,料液比为1∶50 (g/mL)和提取时间为120 min)得到的柿叶总黄酮浓缩液为原料液,并加无水乙醇配制成质量浓度分别为0.002、0.006、0.008、0.010、0.014、0.016、0.03、0.05 mg/mL的样品溶液。参考文献[18]进行DPPH自由基清除活性的测定,并以抗坏血酸作为参照比较效果,按以下公式计算清除率及IC50。

式中：A样品为DPPH溶液+柿叶黄酮提取液的吸光度值;A空白为无水乙醇+柿叶黄酮提取液的吸光度值;A对照为DPPH溶液+无水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 柿叶总黄酮对羟自由基清除活性的测定 将最佳工艺条件下得到的柿叶总黄酮浓缩液加无水乙醇配制成质量浓度分别为0.002、0.006、0.008、0.03、0.05、0.10、0.60、0.80 mg/mL的样品溶液。参考文献[18-20]进行羟自由基清除活性测定,同时与抗坏血酸对比,按以下公式计算清除率及IC50。

式中：A样品为2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿叶黄酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水杨酸的吸光度值;A空白为2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 柿叶黄酮提取液+2.00 mL 6 mmol/L 蒸馏水+2.00 mL 6 mmol/L水杨酸的吸光度值;A对照为2.00 mL 6 mmol/L FeSO4+2.0 mL 蒸馏水+2.00 mL 6 mmol/L H2O2+2.00 mL 6 mmol/L水杨酸的吸光度值。

1.2.6.3 柿叶总黄酮对超氧自由基清除活性的测定 将最佳工艺条件下得到的黄酮浓缩液为原料液,并加无水乙醇配制成质量浓度分别为0.01、0.03、0.06、0.12、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的样品溶液。采用邻苯三酚自氧化法,参考文献[21-23]进行超氧自由基清除活性测定并与抗坏血酸作比较,按以下公式计算清除率及IC50。

式中：A样品为2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8)+1 mL柿叶黄酮提取液+0.2 mL经37 ℃预热过的7.0 mmol/L邻苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A空白为2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8)+1 mL蒸馏水+0.2 mL经37 ℃预热过的7.0 mmol/L邻苯三酚+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值;A对照为2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8)+1 mL柿叶黄酮提取液+0.2 mL蒸馏水+加入0.1 mL 8.0 mol/L HCl的吸光度值。

1.3 数据处理

采用SPASS 20.0、Design-Expert 8.0.6、Microsoft Excel 2007进行实验数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同乙醇浓度对柿叶黄酮提取工艺的影响 由图1可知,黄酮提取量随乙醇浓度递增呈先增加后减少的变化趋势,在乙醇浓度为50%时,总黄酮的提取量达到最大值,为16.11 mg/g。这可能的原因是:一方面,根据相似相溶的原理,极性越接近,溶解度越大,在乙醇体积分数为50%时,溶剂的极性和黄酮的极性最为接近,另一方面当乙醇浓度过高时,一些醇溶性杂质成分溶出量增加,反而导致黄酮类化合物的提取量下降。因此,选择乙醇浓度40%～60%进行优化实验。

图1 不同乙醇浓度对柿叶黄酮提取量影响Fig.1 The effects of ethanol concentration on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.2 不同提取温度对柿叶黄酮提取工艺的影响 由图2可知,随提取温度的升高,柿叶黄酮提取量先升高后下降,在60 ℃时,总黄酮的提取率达到最大值,为13.67 mg/g,可能是由于当温度升高时,柿叶黄酮在乙醇溶液中溶解度升高,因而提取量增加,但是温度过高时,部分黄酮类化合物结构不稳定,会分解,从而导致黄酮提取量降低。因此,选择50～70 ℃进行优化实验。

图2 不同温度对柿叶黄酮提取工艺影响Fig.2 The effects of extraction temperature on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.3 不同料液比对柿叶黄酮提取工艺的影响 由图3可知,随着料液比的增加,黄酮提取量逐渐增大,当料液比大于1∶60 (g/mL)之后,黄酮提取量增速平缓。其主要原因是当料液比大于1∶60 (g/mL)后,黄酮大部分已经溶出,其次,随着提取液所占比例的进一步增加,大量杂质溶出,黄酮提取量缓慢降低,故提取量不再急剧增加。为节约提取成本,因此选择料液比为1∶50～1∶70 (g/mL)进行优化实验。

图3 不同料液比对柿叶黄酮提取工艺影响Fig.3 The effects of material-liquid ratio on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.1.4 不同提取时间对柿叶黄酮提取工艺的影响 由图4可知,提取时间在40～100 min 内总黄酮提取得量不断增大,在提取时间100 min 时,柿叶总黄酮的提取量接近最大值,为15.39 mg/g;当继续延长提取时间,提取量不再明显增大,其原因可能是黄酮类化合物基本达到饱和,不再明显溶出。因此选择提取时间80～120 min进行优化试验。

图4 不同提取时间对柿叶黄酮提取工艺影响Fig.4 The effects of extraction time on extraction quantity of total flavonoids from persimmon leaves

2.2 正交试验结果分析

由表3可知,R值越大,说明该因素的水平变动对试验结果的影响越大,影响柿子叶黄酮提取四个因素顺序为料液比(C)>提取温度(B)>乙醇浓度(A)>提取时间(D)。方差分析表4显示,乙醇浓度和料液比对黄酮提取量的影响存在统计学差异(P<0.05),而提取温度对黄酮提取量的影响无统计学差异(P>0.05)。综合考虑黄酮的最佳提取工艺条件组合为A1B1C1D3,即乙醇浓度为40%,提取温度50 ℃,料液比为1∶50 (g/mL)和提取时间为120 min。根据最佳条件进行验证实验,总黄酮平均提取量为18.11 mg/g,相对标准偏差(RSD)为0.69%,总黄酮提取量较高,重现性较好,表明此提取工艺稳定合理。

表3 正交试验结果直观分析Table 3 Visual analysis of orthogonal experiment results

表4 方差分析结果Table 4 Variance analysis results

2.3 Box-Behnken响应面法实验结果与分析

2.3.1 响应面回归模型建立与分析 采用Box-Behnken的中心原理为依据,以乙醇浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)、提取时间(D)为自变量,总黄酮提取量为因变量,采用四因素三水平响应面优化提取工艺,利用统计学分析软件Design-Expert 8.0.6建立数学回归模型,确定柿叶最佳提取工艺条件,结果见表5。获得回归模型方程如下:Y=12.96+0.017A+0.85B-1.25C-0.069D-0.14AB+0.13AC+0.18AD+0.46BC-0.69BD-0.062CD-0.84A2-0.62B2-1.08C2+0.30D2,式中:Y为总黄酮提取量(mg/g)。

表5 响应面试验结果及分析Table 5 Results and analysis of response surface experiment

表6 回归模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由4个影响因素的F值大小可以得出,各因素对柿子叶总黄酮提取量的影响顺序为:

料液比>提取温度>乙醇浓度>提取时间,料液比对柿子叶总黄酮提取量有较大影响。模型一次项D与交互项AB、AD、BC、BD、CD差异不显著(P>0. 05),一次项A、并互项AC对柿子叶总黄酮提取量具有显著影响(P<0.05),一次项B、C以及二次项A2、B2、C2、D2对柿子叶总黄酮提取量均有极显著的影响(P<0.01)。

2.3.2 响应面交互作用分析与优化 响应曲面坡度越陡峭,说明响应值对于该因素的改变越敏感,而曲面坡度越平滑,该因素的改变对响应值的影响也就越小,各因素交互作用对柿叶中总黄酮提取量影响的响应曲面以及等高线如图5所示。在有交互作用的影响下,乙醇浓度和料液比对柿叶总黄酮的提取的交互影响作用显著,而提取时间和提取温度、乙醇浓度和提取时间、乙醇浓度和提取温度、料液比和提取温度、料液比和提取时间交互影响作用不显著,这与表6中交互项P值的分析一致。

图5 各因素交互作用总黄酮提取量的响应面与等高线图Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of total flavonoids

2.3.3 最佳提取条件的确定及验证 通过软件对二次多项式回归方程进行分析预测,乙醇回流提取柿叶总黄酮的最佳提取工艺条件:乙醇浓度为47.63%,提取温度为50.0 ℃,提取时间为120.0 min,料液比为 1∶65.97 (g/mL)。综合考虑将其最佳工艺条件调整为乙醇浓度50%,提取温度为50 ℃,提取时间为120 min,料液比为 1∶60 (g/mL),以此条件下对建立的数学模型进行验证试验,获得的柿叶总黄酮的实际测得值为(18.21±0.01) mg/g,预测值为18.12 mg/g,预测误差为0.51%,小于3%,因此,证实了预测值的准确可靠。

2.4 柿叶总黄酮体外抗氧化活性

2.4.1 柿叶总黄酮对 DPPH·清除作用 不同浓度的柿叶总黄酮溶液、对照品抗坏血酸溶液对DPPH自由基清除率结果见图6。在浓度0.002～0.05 mg/mL范围内其清除能力随总黄酮浓度的升高而加强,当浓度增加为0.03 mg/mL,清除率达到91.47%,此后其清除率基本趋于平衡。根据SPSS20.0软件数据分析,得到柿叶总黄酮IC50为8.0 μg/mL和抗坏血酸的IC50为11.0 μg/mL,可见,柿叶总黄酮对DPPH自由基清除率明显高于抗坏血酸。

图6 不同浓度的柿叶和抗坏血酸 对DPPH自由基的清除率Fig.6 DPPH· scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 柿叶总黄酮对·OH的清除作用 由图7可知,在选定浓度0.002～0.6 mg/mL范围内其清除能力随总黄酮浓度的提高而增强,当浓度增加到0.6 mg/mL,清除率达到91.18%,此后其清除率增加不明显,基本趋于平衡。根据SPSS20.0软件数据分析,得到柿叶总黄酮IC50=18.0 μg/mL和抗坏血酸的IC50=25.0 μg/mL,这说明在相同浓度下,柿叶总黄酮对·OH清除率比抗坏血酸略强。

图7 不同浓度的柿叶总黄酮和抗坏血酸对·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

图8 不同浓度的柿叶总黄酮和抗坏血酸对 的清除率 scavenging activities of ascorbic acid and total flavonoids

3 结论

正交试验设计的最佳提取工艺为:乙醇浓度为40%,提取温度50 ℃,料液比为1∶50 (g/mL)和提取时间为120 min,总黄酮提取量为18.11 mg/g。响应面法的最佳提取工艺为:乙醇浓度为50%,提取温度50 ℃,料液比为1∶60 (g/mL)和提取时间为120 min,总黄酮提取量为18.21 mg/g。响应面法总黄酮提取量比正交试验法提高了0.55%。两种方法得到的结论也是基本一致的:料液比对总黄酮含量影响显著,各因素对总黄酮含量的影响顺序为料液比>提取温度>乙醇浓度>提取时间,而且两法所得最佳工艺参数中,提取温度和时间一致,正交试验法所得乙醇浓度(40%)和料液比(1∶50 g/mL)低于响应面法的乙醇浓度(50%)和料液比(1∶60 g/mL),从经济角度考虑,低乙醇浓度和低料液比能节约成本和能耗,而两者提取率几乎没有差别。因此,正交试验法更适合柿叶总黄酮提取工艺。

体外抗氧化活性研究表明,柿叶总黄酮对DPPH·、羟自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为:8.0、18.0、76.0 μg/mL,具有较强的体外抗氧化活性,为其在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂提供一定的理论依据。