李海霞，陈俊文，曾晓房，姚 敏，吕亮莹，黄桂颖，冯卫华，肖根生，杨婉如

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510550；2.广东佳宝集团有限公司，广东潮州 515638）

在食品中清除二氧化硫残留方法或者将食品中二氧化硫残留量降低到安全水平的一类研究课题，是现在国内外的研究热点，寻求有效的降硫技术是广式凉果行业亟待解决的关键问题，但是至今还没有一种完善的方法能彻底解决这一问题[1]。

为了保证广式凉果常年生产，在加工过程中会用硫藏法来腌制浸泡果蔬原材料，从而达到防腐杀菌、漂白、防褐变的目的[2]。该方法成本低、方便操作，目前尚无更好的方法能代替。但是在生产过程中应用不当的情况下，就会导致半成品中的亚硫酸盐超量，或在制作成品前脱硫不足，会造成成品中二氧化硫严重超标。近年来，广式凉果由于二氧化硫残留量超标的负面事件时有发生[3-7]，导致广式凉果的美誉受损。更重要的是，广式凉果的兴衰与上游水果种植产业密切相关，市场经济的低迷导致水果市场的萎缩，严重影响到贫困山区农民致富及社会稳定。

因此，综合国内外最新食品中降硫技术的研究进展，提取蔬菜中的叶绿体进行降硫试验，对比不同蔬菜中叶绿素的含量及叶绿体清除SO2效果，并且分析蔬菜中叶绿体清除广式凉果中二氧化硫的反应条件，以期为广式凉果开发新型降硫技术提供新思路和重要途径，推动广式凉果产业的健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菠菜、芥蓝、生菜、芥菜、潺菜，购于海珠区滨江中路滨江菜市场；硫藏橄榄，紫金华丰国际食品企业有限公司提供。

1.2 试验试剂

碳酸钙粉、氯化钠、亚硫酸氢钠、无水乙醇、盐酸、盐酸副玫瑰苯胺、乙酸锌、亚铁氰化钾、氯化钡、磷酸、柠檬酸、四氯汞钠、甲醛、氨基磺酸铵、可溶性淀粉、碘、硫代硫酸钠，均为分析纯。

1.3 试验仪器

电子天平，广州市正一科技有限公司产品；贝克曼，上海博迅实业有限公司产品；马佛炉，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂产品；离心机，江苏省国金实业有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 蔬菜中叶绿素提取

蔬菜中叶绿素的提取工艺按照参考王向丽等人[8]的方法进行。

叶绿体提取工艺流程

新鲜蔬菜→清洗→取叶→黑暗预冷嫩化→匀浆提取→抽滤得滤液→低速离心→取滤液→高速离心→取滤渣→叶绿体悬浮液→4℃下冷藏备用。

1.4.2 蔬菜中叶绿素浓度测定

参考郝建军等人[9]的方法略加修改。取新鲜植物叶片，洗干净，檫干去掉叶脉；称取2 g样品，进行研磨并加入石英砂、碳酸钙粉及95%无水乙醇3 mL均浆，无水乙醇10 mL，研磨至组织变白；静置3～5 min；过滤，无水乙醇定容至100 mL，摇匀；取叶绿体色素提取液于波长665，645，652 nm处测定吸光度，以95%无水乙醇为空白对照。

1.4.3 二氧化硫含量测定

二氧化硫含量测定按照《GB/T 5009.34—2003食品中亚硫酸盐测定》中第一法——盐酸副玫瑰苯胺法。

（1）原理。亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫色络合物，与标准系列比较稳定。

（2） 试剂。①四氯汞钠吸收液，13.6 g氯化高汞、6.0 g氯化钠，稀释至1 000 mL，放置过夜，过滤备用。②氨基磺酸铵溶液（12 g/L）。③甲醛溶液（2 g/L），吸取0.55 mL无聚合沉淀甲醛，加水稀释至100 mL，混匀。④亚铁氰化钾溶液，称取10.6 g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100 mL。⑤称取22 g乙酸锌、3 mL冰乙酸，定容至100 mL。⑥二氧化硫标准溶液，称取0.5 g亚硫酸氢钠，溶于200 mL四氯汞钠吸收液中，放置过夜，上清液用定量滤纸过滤备用；吸取10.0 mL亚硫酸氢钠-四氯汞钠溶液于250 mL碘量瓶中，加100 mL水，加入20.0 mL碘溶液，5 mL冰乙酸，摇匀，放置于暗处；2 min后迅速以硫代硫酸钠标准溶液滴定至黄色，加0.5 mL淀粉指示剂，滴定至无色，并做试剂空白试验；标定后二氧化硫标准溶液浓度为1.04 mol/L。⑦盐酸副玫瑰苯胺溶液，称取0.1 g盐酸副玫瑰苯胺于研钵中，加少量水研磨使溶解并稀释至100 mL；取20 mL，置于100 mL容量瓶中，加盐酸，充分摇匀后使溶液由红变黄；如不变再加少量盐酸至出现黄色，再加水稀释至刻度，混匀备用。⑧二氧化硫使用液，临用前将二氧化硫标准溶液以四氯汞钠吸收液稀释至每毫升相当于2μg二氧化硫。

（3）试样处理。将样品用粉碎机粉碎，各称取5 g，分别置于6个锥形瓶中，标号。1，2，3号中，磷酸-柠檬酸缓冲液浓度为0.1 mol/L，pH值7.0，加入从10 g蔬菜中提取的叶绿素，在室内25℃摇床均匀振荡（100 r/min） 光照反应5 h；反应后过滤，备用；加入20 mL四氯汞钠吸收液，浸泡4 h以上，若上层溶液不澄清可加入亚铁氰化钾及乙酸锌各2.5 mL，最后定容至100 mL，过滤后备用。

（4） 试样测定。吸取0.5 mL上述试样溶液处理液置于10 mL带塞比色管中。另吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00 mL二氧化硫使用液，分别置于10 mL带塞比色管中。于试样及标准管中各加入四氯汞钠吸收液至10 mL，然后再加入1 mL氨基磺酸铵、1 mL甲醛及1 mL盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，放置20 min。于波长550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。

（5） 计算。

式中：X——试样中二氧化硫含量，g/kg；

A——测定用样液中二氧化硫质量，μg；

m——试样质量，g；

V——测定用样液的体积，mL。

二氧化硫含量标准曲线图见图1。

1.4.4 叶绿素体外脱除二氧化硫试验

叶绿素脱除二氧化硫试验采用无机沉淀法[10]。

1.4.5 叶绿素脱除硫藏橄榄中二氧化硫试验

将硫藏橄榄肉核分离，然后用粉碎机粉碎果肉，分别称取5 g硫藏橄榄，磷酸-柠檬酸缓冲液浓度为0.1 mol/L，pH值7.0，加从10 g蔬菜中提取的叶绿素于250 mL三角瓶中。另称取5 g硫藏橄榄，磷酸-柠檬酸缓冲液浓度为0.1 mol/L，pH值7.0。在室内25℃摇床均匀振荡（100 r/min） 光照反应5 h，反应后盐酸副玫瑰苯胺法测定二氧化硫含量。

2 结果与分析

2.1 蔬菜中的叶绿素含量分析

不同蔬菜中叶绿素含量分析见图2。

由图2可知，不同蔬菜中叶绿素含量具有明显差异，其中芥菜中叶绿素含量最高，达1.547 8 mg/g；其次为芥蓝、菠菜和潺菜，叶绿素含量分别达1.069 6，0.724 6，0.469 1 mg/g，而生菜中叶绿素含量最少，为0.367 1 mg/g。

验证池共识机制在基于传统的共识算法上进行了改进，适用于几大商业中心的联合建链。该方案是基于传统的拜占庭容错（BFT）及其变种的共识方案，需要参与者能够相互辨识，不需要发币即可实现。验证池算法十分高效，可以实现秒级共识。

2.2 蔬菜中叶绿体脱硫效果分析

分别取10 g蔬菜（菠菜、芥蓝、生菜、芥菜和潺菜）进行二氧化硫的体外脱除试验，研究其对亚硫酸盐溶液中二氧化硫的脱除效果。

不同蔬菜中的叶绿体体外脱硫效果见图3。

由图3可知，等量（10 g） 蔬菜中叶绿体的脱硫效果不同，其中菠菜的叶绿体脱硫效果最好，达到91.33%；其次为芥蓝、生菜和潺菜，脱硫率分别达到82.14%，80.55%，74.49%，而芥菜的脱硫效果相对较差，仅为72.03%。

同时，由于蔬菜中单位叶绿体的含量不同，因此不同蔬菜中叶绿体的脱硫能力差异较大。芥菜中单位叶绿体的含量最高，但等量蔬菜条件下其脱硫效果最差，由此可知，芥菜中的叶绿体脱硫能力不强。综合蔬菜中叶绿体的含量和等量蔬菜脱硫率的数据可知，生菜中叶绿体的脱硫能力最强，其次为潺菜、菠菜和芥蓝，而芥菜中叶绿体的脱硫能力最差。

2.3 蔬菜中叶绿体对硫藏橄榄的脱硫效果

取10 g菠菜进行叶绿素脱除硫藏橄榄二氧化硫效果试验。

蔬菜中叶绿体对硫藏橄榄中二氧化硫的脱除效果见表1。

表1 蔬菜中叶绿体对硫藏橄榄中二氧化硫的脱除效果

由表1可知，对于二氧化硫残留超标的硫藏橄榄（GB 2760—2007，二氧化硫残留≤0.35 mg/kg），经过叶绿素处理后能达到国家标准，叶绿素对硫藏橄榄中二氧化硫的脱除率为50.86%。

2.4 pH值对蔬菜中叶绿体脱除硫藏橄榄的二氧化硫影响

取20 g蔬菜中提取的叶绿素与5 g硫藏橄榄反应，在室温、正常光照条件下，摇床均匀缓慢振荡处理。

pH值对蔬菜中的叶绿体体外脱硫效果见图4。

pH值为6时，二氧化硫清除率最低；pH值为7时，叶绿素清除5 g硫藏橄榄中二氧化硫效率最高，反应2 h后二氧化硫清除率为40.36%；但pH值为8时，二氧化硫的清除率下降，为32.42%。因此，当pH值为7时蔬菜中的叶绿体清除二氧化硫的效率最高。

2.5 反应时间对蔬菜中叶绿体脱除硫藏橄榄中二氧化硫的影响

反应时间对蔬菜中的叶绿体体外脱硫效果的影响见图5。

取20 g蔬菜中提取的叶绿素与5 g硫藏橄榄反应，在室温下，pH值8.0，正常光照下，摇床均匀缓慢振荡处理。由图5可知，反应5 h后，SO2脱除率为93.36%。与反应时间呈正相关，反应时间越长，二氧化硫清除率越高。

2.6 反应温度对蔬菜中叶绿体脱除硫藏橄榄的二氧化硫的影响

反应温度对蔬菜中的叶绿素体外脱硫效果的影响见图6。

不同的反应温度对蔬菜中叶绿素催化脱除硫藏橄榄中的二氧化硫的影响结果，由图6可知，在5～35℃反应温度下，二氧化硫脱除率随反应液温度的升高而增大，当反应温度达到25℃时反应进行2 h后二氧化硫脱除率为34.48%；温度升高到35℃时二氧化硫脱除率为37.79%。

2.7 不同蔬菜量中叶绿素脱除硫藏橄榄中二氧化硫的影响

不同蔬菜量中的叶绿素体外脱硫效果见图7。

反应pH值为7.0，反应时间为2 h，其他条件一样，改变提取蔬菜的用量。由图7可知，叶绿体溶液用量增加的同时，二氧化硫脱除率也会越高，叶绿体的用量与二氧化硫的脱除率呈正相关。所以适当增加叶绿体溶液用量有利于脱除二氧化硫残留。

2.8 其他条件对蔬菜中叶绿素脱除硫藏橄榄中二氧化硫的影响

其他条件对蔬菜中的叶绿素体外脱硫效果的影响见图8。

取20 g蔬菜中提取的叶绿体与5 g硫藏橄榄反应中，pH值7.0，对光照、振荡和密闭条件处理2 h进行对比试验。由图8可知，在光照、振荡、敞开状态下，叶绿体脱除硫藏橄榄中的二氧化硫的效率均高于在黑暗、静止、密封状态下，由此可说明叶绿体脱除硫藏橄榄中的二氧化硫活性成分需要光照、氧气和振荡。

3 结论

通过比较不同蔬菜中叶绿素含量及其脱硫效果，以及蔬菜中叶绿素对硫藏橄榄脱硫效果研究，结论如下：

5种蔬菜（菠菜、芥蓝、生菜、芥菜和潺菜）中叶绿素含量具有明显差异，其中芥菜中叶绿素含量最高，达1.547 8 mg/g；其次为芥蓝、菠菜和潺菜，而生菜中叶绿素含量最少，仅为0.367 1 mg/g。

等量（10 g）蔬菜中叶绿体的脱硫效果不同，其中菠菜的叶绿体脱硫效果最好，达91.33%；其次为芥蓝、生菜和潺菜，而芥菜的脱硫效果相对较差，仅为72.03%；综合蔬菜中叶绿素的含量以及等量蔬菜脱硫率的数据可知，生菜中叶绿体的脱硫能力最强，其次为潺菜、菠菜和芥蓝，而芥菜中叶绿体的脱硫能力最差。

蔬菜中叶绿体对硫藏橄榄中的二氧化硫脱除效果较好，10 g菠菜中的叶绿体对5 g硫藏橄榄中二氧化硫的脱除率为50.86%。

pH值为7时，叶绿素清除5 g硫藏橄榄中二氧化硫效率最高，反应2 h后二氧化硫清除率为40.36%；反应时间越长脱除率越高，反应5 h后，二氧化硫的脱除率达到93.36%；在5～35℃时，二氧化硫脱除率随反应液温度的升高而增大。适当增大叶绿体溶液用量有利于脱除二氧化硫残留。叶绿素脱除硫藏橄榄中的二氧化硫的活性成分需要光照、氧气和振荡。