陈思华　梁顺智　郭海芬　黄美静　柯德森

摘要：以一种耐高糖高活性干酵母为研究对象，采用钼酸铵分光光度法对其在不同碳源及是否破碎细胞壁等多种条件下培养的除磷率进行分析。对酵母进行固定化，并对固定化酵母的除磷率变化，以及固定化酵母的可重复使用性能进行分析。结果表明：在一定时间内，酵母菌破碎细胞壁后的除磷率显著增大;没有碳源时酵母菌除磷率最低，果糖为碳源时除磷效果比蔗糖和葡萄糖为碳源时的好，差异达到显著水平;酵母菌固定化之后的除磷率显著高于不固定化时的;重复使用对固定化酵母菌除磷效果具有显著影响。研究结果可为酵母菌应用于污水中磷的处理和控制提供依据。

關键词：酵母;除磷;固定化;碳源;破壁

中图分类号：X131 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2020）06-0-03

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2020.06.072

Study on analysis and optimization of factors affecting phosphorus removal in yeast

Chen Sihua，Liang Shunzhi，Guo Haifen，Huang Meijing，Ke Desen

（School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou Guangdong 510006，China）

Abstract：A high-sugar-resistant and highly active dry yeast was studied by ammonium molybdate spectrophotometry to analyze its phosphorus removal rate with different carbon sources and cell wall broken. Then immobilized the yeast and analyzed the rate and reusable performance. The results showed that the dephosphorization rate of yeast after breaking cell wall increased significantly in a certain period of time; it was the lowest when there was no carbon source， and the dephosphorization effect of fructose as carbon source was better than that of sucrose and glucose as carbon source. The rate after immobilization was higher than that without immobilization， and the effect of repeated use on phosphorus removal of immobilized yeast was significant. The results can provide the basis for the application of yeast to the treatment and control of phosphorus in sewage.

Key Words：Yeast;Phosphorus removal;Immobilization;Carbon source;Cell wall broken

水是人类赖以生存与经济社会发展不可替代的基础性资源[1]。而目前我国水体富营养化情况日益严重，湖泊污染问题尤为突出[2]。总磷等营养盐超标是水体富营养化最直观的表现[3]。磷过量输入可使湖库浮游藻类异常增殖，水体溶解氧和透明度显著降低，衍生的藻毒素、嗅味物质等会对生态系统和人类健康产生严重危害[4]。因此，对水体中的磷含量进行控制十分必要。磷在废水中的形式可分为无机磷和有机磷，聚磷酸盐或有机磷最后都会部分或全部转化为正磷酸盐，因此，在废水除磷过程中主要关注正磷酸盐[5]。目前最常用的除磷方法是化学沉淀法和生物法[6]。在生物法中，除磷微生物常为聚磷菌（PAOs）和反硝化除磷菌（DPB）[7-10]。而酵母菌既具有单细胞生长快、能形成很好的絮体适应于各种不同的反应器等特点，又具有真菌细胞大、代谢旺盛、耐酸、耐高渗透压、耐高浓度的有机底物等特性[11]。近年来出现了对酵母菌在除磷方面的研究，如渡部贵志[12]研究可大量吸收磷的酵母菌，其吸收磷的情况受PHO机制所控制;王琰[5]筛选出高效除磷酵母菌BZ，并考察了温度、碳源种类、pH、碳磷比、溶解氧、微量元素对BZ除磷效能的影响。但目前对酵母菌除磷方面的研究仍然较少。本研究旨在以常规的酵母菌为模式生物，对酵母菌在不同处理下的水体脱磷效果上进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

耐高糖高活性干酵母（购买自安琪酵母股份有限公司）;葡萄糖;蔗糖;果糖;50 g/L三氯乙酸溶液;3 mol/L硫酸和25 g/L钼酸铵等体积混合液;0.01 mol/Lα-1，2，4-氨基萘酚磺酸钠溶液;0.59 mol/L磷酸盐缓冲液;0.05 mol/L氯化钙溶液;70 g/L海藻酸钠溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 不同条件实验设计

对酵母菌设计4个处理：①破壁（重复6次）与不破壁（重复2次）;②使用不同碳源：葡萄糖（重复6次），蔗糖（重复6次），果糖（重复4次）与无碳源（重复2次）;③固定化（重复4次）与不固定化（重复2次）;④固定化重复使用0、1、2、3次（均重复3次）。以等体积相同浓度的磷酸盐溶液和等质量的酵母菌和碳源混合（m酵母菌：m碳源=3：2）。

1.2.2 无机磷的测定

每隔一定时间取样，采用钼酸铵分光光度法测其660 nm处的分光光度值，计算磷的含量，结果表示为：平均值±标准差。前3个处理以0～60 min磷含量下降的速率表示除磷效率，第4个处理以0～18 min磷含量下降的速率表示除磷效率。

1.2.3 酵母菌固定方法

采用海藻酸钙包埋法对酵母菌进行固定[13]。

1.2.4 数据分析方法

采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，以各平行实验的平均值表示实验结果，以單因素方差分析判断实验组之间的差异显著程度。

2 结果

2.1 破碎细胞壁对酵母菌除磷效果的影响

将酵母菌破壁，与不破壁的酵母菌在同样条件下进行除磷对比，结果可见：不破碎细胞壁时除磷率为13.26±5.04%，破碎细胞壁时为28.64±2.67%，如图1所示。对数据进行单因素方差分析，得P<0.01，说明破碎细胞壁与否对酵母菌除磷效果具有极显著性差异。在其他条件相同且适宜的情况下，破碎细胞壁更有利于酵母菌在一定时间内的除磷。

2.2 不同碳源对酵母菌除磷效果的影响

将酵母菌于其他条件相同的情况下，在不同碳源中进行除磷实验，分析重复得到的除磷率平均值，结果可见：果糖为42.40±14.43%，葡萄糖为28.64±2.67%，蔗糖为30.90±4.20%，无碳源供给时为12.48±1.54%，如图2所示。对数据进行单因素方差分析，得P<0.01，说明碳源种类不同对酵母菌除磷效果具有极显著性差异。LSD分析可知，果糖为碳源时除磷率显著大于蔗糖、葡萄糖和无碳源时的，无碳源条件下酵母菌除磷率最低。

2.3 固定化对酵母菌除磷效果的影响

将酵母菌进行固定化，与未固定化的酵母菌在同一条件下进行除磷实验，分析重复得到的除磷率平均值，从结果可见：未固定化时为13.26±5.04%，固定化时为29.86±4.50%，如图3所示。对数据进行单因素方差分析，得P<0.05，说明对酵母菌进行固定化处理更有利于酵母菌在一定时间内的除磷，其差异达到显著性。

2.4 固定化酵母菌的重复多次除磷效果分析

将酵母菌进行固定化，进行连续三次重复除磷实验。分析3次重复得到的除磷率平均值，从结果可见：固定化酵母菌第一次使用时除磷效率为20.22±4.19%，重复使用1、2、3次的除磷效率分别为11.79±6.70%、5.62±4.12%和6.58±5.79%，如图4所示。对数据进行单因素方差分析，得P<0.05，说明重复使用对固定化酵母菌除磷效果具有显著性影响。观察固定化酵母菌的外观，第一次使用时海藻酸钙凝胶球小，随着重复使用次数增加，凝胶球变大，在重复使用2次时开始破裂。

3 讨论与结论

由图1可见，破碎细胞壁更有利于酵母菌在一定时间内的除磷。王琰[5]研究发现，液相中磷是通过胞外聚合物（EPS）的吸附作用和酵母菌细胞对磷的吸收和转化作用去除的，酵母菌BZ除磷系统中最主要的磷去除途径是细胞对磷的吸收和转化作用。酵母菌之所以能除磷，和细胞中含有能将无机磷转化为磷酸酯等有机磷的酶密切相关，如3-磷酸甘油醛脱氢酶。破壁后细胞表面通透性增加[14]，无机磷无须通过细胞壁，更易于被细胞吸收;且细胞结构很有可能遭到破坏，胞内酶释放到液相中，直接催化无机磷的转化，因此在相同时间内破除细胞壁后酵母菌除磷率提高。

在图2中，无碳源提供时酵母菌除磷率最低。一方面，糖原是酵母菌除磷系统中主要的储能物质，葡萄糖先消耗ATP被磷酸化，然后合成糖原[5]。因此，液相中无葡萄糖等单糖或二糖提供时，酵母菌体内对磷酸的需求量减少，除磷率下降;此外，酵母菌的生命活动，如对磷的吸收和转化作用，需要外界提供能源，碳源在此是唯一的能源，没有能源提供时，酵母菌难以对无机磷进行吸收和转化，因此无碳源提供时除磷率最低。果糖为碳源时除磷率在其中显著最大的原因尚未清楚，有待进一步的探究。而蔗糖和葡萄糖为碳源时除磷率显著小于果糖为碳源时，可能是由于酵母菌中存在非常活跃的转化酶，当蔗糖为碳源时，可迅速将其转化为葡萄糖和果糖[15]。

在图3中，对酵母菌进行固定化处理时除磷率显著大于未固定化时的。一方面，海藻酸钙对无机磷有一定的吸附作用[16];另一方面，将酵母菌固定化则导致酵母菌集中，在特定区域的浓度更高，催化无机磷转化的酶的浓度也因此更高，所以对无机磷的吸收也更快。

重复使用次数对固定化酵母菌除磷效果具有显著性差异，固定化酵母菌第一次使用时的除磷率显著大于重复使用第2、3次时的，这与海藻酸钙凝胶球的大小和破裂情况密切相关。采用海藻酸钙包埋法对酵母菌进行固定，营养物质和氧气不易传递到凝胶珠内部，这样包埋于海藻胶粒中的生长细胞，存在于胶粒表面区域的易于优先繁殖，导致传质阻力的增加和胶粒破裂引起细胞泄漏[16]。且酵母菌在胶粒中正常发酵并产生气体，随着酵母菌的繁殖产生的气体也随之增加，由于胶粒空间相对小、孔径有限，无法使气体及时释放，一定程度上也造成胶粒的破裂。胶粒中酵母菌浓度减小，对无机磷的吸附作用也下降，故而除磷率降低。这暴露了海藻酸钙包埋法的一些缺点，在今后的研究中可采取一些改良的方法以提高重复使用的固定化酵母菌的除磷效果，如史沫男的海藻酸钠-铁凝胶球[17]，牛曼的壳聚糖-海藻酸钠凝胶球[18]。

本研究对购买自安琪酵母股份有限公司的耐高糖高活性干酵母进行破碎细胞壁、在三种不同碳源及无碳源的情况下培养、固定化、固定化重复使用的四种处理时的除磷效果方面进行了研究。酵母菌破碎细胞壁后的除磷率显著大于不破碎细胞壁时的;不提供碳源时酵母菌除磷率最低，果糖为碳源时除磷效果显著比蔗糖和葡萄糖时的好;酵母菌固定化之后的除磷率显著高于不固定化时的;重复使用次数对固定化酵母菌除磷效果具有显著性差异。对于酵母菌在不同处理下的除磷效果上的研究可为酵母菌应用于污水中磷的处理和控制提供参考。

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[18]牛曼.壳聚糖—海藻酸钠固定化藻菌处理高浓度有机废水的研究[D].广州：华南理工大学，2010.

收稿日期：2020-03-30

基金项目：广东省自然科学基金（2014A030313531）;广州大学省级大学生创新训练项目（基于固定化酶技术的水体脱磷工艺研究，S201911078065）。

作者簡介：陈思华（1999-），女，汉族，本科生，研究方向为生物科学。

通讯作者：柯德森（1966-），男，汉族，博士，教授，研究方向为氧代谢和抗氧化。