张金梅 白雪 李玥莹

摘要 植物经常面临大量的逆境胁迫，这些逆境胁迫会对植物造成一些不利影响。为了应对这些胁迫，植物通过一个严格调控的网络机制来迅速作出响应。WRKY家族是一类广泛参与响应胁迫的转录因子家族，作为激活因子或者抑制因子来参与转录组的重新编程。综述了逆境胁迫中WRKY基因在植物抗性机制中扮演的“角色”及其发挥的作用。

关键词 WRKY;逆境胁迫;调控;角色

Abstract Plants often face a great deal of stress，which will have some adverse effects on plants.In response to these stresses，plants respond quickly through a tightly regulated network of mechanisms.WRKY family is a family of transcription factors that are widely involved in response to stress and participate in transcriptome reprogramming as activators or inhibitors.In this paper，we reviewed the role of WRKY gene in plant response to stress and homology in other plants.

Key words WRKY;Stress of adversity;Regulation;Role

植物在逆境脅迫下会引发很多问题，如合成激素信号通路的中断，干扰激素信号传导会抑制植物的生长和发育，光合作用受到抑制，诱导植物衰老，细胞程序性死亡，细胞损伤，活性氧生成增加，细胞内稳态和渗透调节平衡受到破坏，严重时将导致植物死亡[1-3]。为了应对各种逆境胁迫，植物通过一系列生理、代谢以及分子水平上的防御机制来提高植物的耐受能力。

WRKY转录因子是存在于高等植物中的一大类转录调控因子，它是通过特异性的结合目标基因启动子的W-box、WRKY域和其他蛋白质的相互作用，还有翻译后修饰加工[4-8]。WRKY在逆境胁迫中会扮演不同的“角色”，控制参与响应胁迫的关键物质的生物合成。植物在逆境胁迫下形态、生理以及分子机制方面都会发生变化，WRKY在这一系列变化中起重要作用。Bai等[9]报道在番茄中有83个WRKY基因被鉴定出来。万红建等[10]报道了这些WRKY基因广泛参与生物与非生物胁迫。

1 WRKY参与非生物胁迫与生物胁迫

WRKY转录因子是植物生长和发育的主要调节因子。盐胁迫条件下的WRKY蛋白参与植物的不同生理和发育过程，如种子大小调节、种皮发育、叶片发育和叶片衰老调节[11-12]。WRKY转录因子参与不同水平的激素调节，响应植物在各个发育阶段的胁迫，如在盐胁迫和渗透胁迫下，植物激素脱落酸在响应胁迫中快速积累，吲哚乙酸、赤霉素、茉莉酸、水杨酸、油菜素类固醇和乙烯ctr1-1或EIN3的过量表达从而提高耐盐性，诱导或调节种子萌发率和幼苗生长[13]。从陆地棉（Gossypium hirsutum）中分离出WRKY41（GhWRKY41）并转化到烟草（Nicotiana benthamiana）中，得到转基因植株，GhWRKY41过表达，降低了植株中丙二醛含量，调节气孔关闭，抗氧化酶活性增强以及相关基因的上调，使植物对盐和干旱胁迫的抗性增强[11-12]。在王秀玲等[14]研究中转基因植物GhWRKY40过表达植株在对生物胁迫青枯细菌的侵染中表现出敏感性。GhWRKY40在SA/JA信号途径中起作用，且对伤胁迫和青枯细菌侵染的响应具有协同作用，经验证GhWRKY40和GhMPK20互作于细胞核内， GhWRKY40被GhMPK20激活表达参与胁迫响应。

WRKY转录因子也参与干旱胁迫应答，植物在干旱胁迫下严重降低了芽和幼苗的数量，显著降低了植物水分利用效率，影响植物光合作用，导致光合色素和成分变化、光合器官受损和卡尔文循环酶的活性下降，同化物分配降低了光合速率，扰乱了叶片的碳水化合物代谢和蔗糖水平，使呼吸代谢速率下降，导致植物在碳资源的利用中不平衡、生成氧种类减少等影响。AtWRKY40在拟南芥应对干旱胁迫响应中调节一系列抗氧化酶活性从而响应干旱胁迫诱导[15];AtWRKY40缺失导致干旱胁迫下种子的萌发率降低，叶片失水加剧，当它过表达时则表现相反的表征，较于野生型植株，AtWRKY40缺失突变体植株叶片的抗氧化酶活性、脯氨酸（Pro）以及相关基因AtCu/ZnSOD、AtCAT1、AtP5C1S、AtG6PD5和AtBAM4表达量和可溶性糖含量都显著降低，而过表达株系则比野生型植株的抗氧化酶活性、基因的表达量和渗透物质的含量都显著增高[16]。AtWRKY40在应对病原菌的侵染过程中受病原菌的诱导，从而合成一些植保素来防御病原菌的侵害。也与其同一来源的基因串联复制使被侵染病原菌的植株抗性增强。

袁柳娇等[17]根据转录组分析发现了秋茄通过调节自身的基因表达情况来提高自身对受污染环境中重金属的耐受能力。对于金属非超积累植物，谷胱甘肽（GSH）和植物金属螯合素（PC）之间的平衡对于提高Cd的耐受能力非常重要。当AtPCS1基因过表达时，PC的合成升高，导致GSH的消耗，这有助于增强氧化应激和Cd的敏感表型[18]。 研究发现，WRKY13通过谷胱甘肽独立的PC合成途径调控Cd耐受，WRKY蛋白可以作为转录激活因子或者转录抑制因子。作为转录激活因子时，通过直接与PDR8启动子的W-box结合，正向调节镉耐受，合成木质素，而作为转录抑制因子与下游靶基因作用，控制开花时间。水稻WRKY13选择结合顺式作用元件W-box结构完全不同类型的PRE4元件，调控不同胁迫中信号路径间的交互作用，如在水稻受干旱胁迫时发挥抑制功能调节气孔关闭，可以与SNAC1启动子区不同的顺式作用元件选择性结合进行负调控;当选择性结合到WRKY45启动子区不同的顺式作用元件上，也可以发挥同样的抑制功能。在水稻受病原菌侵染过程中，还可以结合另一个与W-box结构完全不同的PRE4顺式作用元件，激活自身基因的表达[19]。

2 WRKYs组成的基因簇协同作用

在植物防御系统中拟南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60这3个结构相关的转录因子均受病原菌的诱导[20]，研究表明这3个转录因子可以形成AtWRKY18-40-60簇，且是ABA信号调节的关键因子。形成同源和异源复合物是通过自身的亮氨酸拉链结构，所以产生的 WRKY蛋白的DNA结合活性会有显著差异。基因簇是通过单个基因重复产生的多个拷贝，因此来源、结构和功能以及由其编码的蛋白质产物都存在相似性，这类家族基因一个区域内串联复制紧密排列在一起形成一个基因簇。高密度基因簇，包括Hox域和C2H2锌指结构基因域等[21]。一个基因簇组成的突变体能够增强植物的基础防御作用，对防御途径中的平衡也起重要作用，协同调控使植物抗性增强[22-23]。

ATWRKY18是一种病原和水杨酸诱导的拟南芥转录因子，包含植物特异性WRKY锌指DNA结合基序。ATWRKY18的高水平表达转基因植物生长迟缓，当在中等水平表达时，ATWRKY18增强了转基因植物的发育，调节防御反应，且不会对植物生长造成实质性的负面影响。ATWRKY18增强发育、调节防御反应需要抗病调节蛋白npr1/nim1。因此，ATWRKY18可以积极调节防御相关基因的表达和抗病性[24]。ATWRKY40是作为抑制因子抑制抗霉素A诱导的高光诱导信号传导和线粒体的逆行表达，ATWRKY40也是参与调节编码线粒体和叶绿体蛋白的应激反应基因。此外，ATWRKY40参与调节线粒体和叶绿体的功能，逆境胁迫下共同激活应答基因的表达。研究表明，ATWRKY40在植物干旱胁迫反应中也发挥了积极作用，可能是通过干扰活性氧清除途径和渗透液积累过程。干旱胁迫下，野生型植物WRKY40表达强烈，功能丧失突变体在干旱条件下种子发芽率下降，叶片失水率上升，而在过表达系中则表现出相反的趋势。此外，ATWRKY40突变体植株积累的丙二醛（MDA）比野生型和过度表达植株多，表明突变体脂质过氧化水平提高。WRKY18、WRKY40、WRKY60产生的WRKY蛋白在植物响应2种不同类型的病原体中具有部分冗余的作用，WRKY18比其他2种更重要[20]。病原菌侵染时，三突变体比野生型防御对半活体营养型细菌表现更抗，但对坏死营养型真菌表现更感。在进行基因敲除时，必须将3个基因全部敲除才能达到目的。

研究发现，在假单孢杆菌和黑球病菌侵染的巨桉植株中，EgrWRKY70、EgrWRKY46、EgrWRKY53这3个结构类似的基因与激素水杨酸、茉莉酸甲酯具有协同作用，且诱导起正调控作用表现出抗性[22，25-26]。研究还发现，参与Br油菜素甾体类调控的植物生长和干旱响应过程中3个拟南芥WRKY转录因子WRKY46、WRKY54和WRKY70结构相似功能冗余，这三重突变体在干旱胁迫下对Br调控的植株生长存在缺陷，但耐受性更强。经转录组测序分析表明，在促进Br介导的基因表达和抑制干旱反应基因中直接相互作用的是WRKY54与BES1，协同调控靶基因的表达，WRKY54被类似GSK3的激酶Br-Insensive2磷酸化，BES1是Br通路的负调节因子[27]。

3 WRKY调节代谢物的生物合成

WRKY转录因子调节特定代谢物的产生，作为特化代谢的关键调控因子，如通过调控乙烯合成酶相关基因的表达，参与其生物合成[28-29]。WRKY转录因子被发现是控制代谢的关键限速步骤，调节多种酚类化合物的产生，调节苯丙类通路中木质素的产生，控制黄酮醇和单宁化合物的生成，所以它也是生物堿代谢的关键调控因子。WRKY转录因子对萜烯通路的调节，如从陆地棉中分离出来的GaWRKY1，从黄花蒿中分离出来的AaWRKY1，从水稻中分离出来的OsWRKY13，分别作用特定代谢的关键酶CAD1-A、ADS、查尔酮合成酶（CHS），特异性结合相关的启动子ADSpro2、Os01g24980、Os08g44830，从而合成倍半萜类棉子酚、倍半萜类青蒿素、倍半萜类黄酮[30-35]。

4 WRKY参与植物信号转导

WRKY转录因子参与植物胁迫响应中的信号通路，参与许多植物激素信号转导级联包括脱落酸、生长素、油菜素、类固醇、细胞分裂素、乙烯、茉莉酸和水杨酸等[36]。研究发现，丝裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated proteinkinase，MAPK） 介导的磷酸化调控会影响某些 WRKY 转录因子的活性[37]。当受到胁迫应激时，植物活性氧的大量积累，氧化信号诱导型OX1蛋白检测到了植物细胞中ROS的产生和积累，这些蛋白质就会刺激下游丝裂原活化蛋白激酶级联的快速信号转导，在胞质中MAPK级联是从MKKK到MKK再到MPK的三级磷酸化，来自MAPK级联的信号将进一步转导至转录因子激活细胞核中的转录因子功能，结合特定的顺式作用元件并诱导响应抗性相关基因脱落酸等的表达[36，38]。WRKY转录因子应激调控OsBWMK1S的表达，在应答过程中发生了不同程度的磷酸化，在OsMKK6转基因过表达植株中，OsWRKY50表达上调，在依赖水杨酸的防御反应中，OsBWMK1磷酸化与PR基因启动子结合的W-box序列，OsWRKY53作为OsMPK3/OsMPK6正调控因子，并与这些MPKs相互作用，降低了茉莉酸和乙烯的诱导，提高了抑菌效果[39-40]。

5 WRKY影响表观遗传学调控

表观遗传学是控制染色质的可达性，全基因组的染色质修饰，DNA的复制、修复以及结合的转录机制，有DNA甲基化和乙酰基化等[41]。表观遗传对水稻WRKY基因的表达有一定影响。WRKY基因的应答在DNA甲基化水平上被调控。在耐旱条件下，水稻OsWRKY70 和OsWRKY45甲基化程度高则表现为下调，甲基化程度低OsWRKY90表现为上调;盐胁迫下，OsWRKY104高程度甲基化基因表现为下调[42]。在种子发育过程中，OsWRKY2甲基化程度的变化和表达变化之间呈负相关，此外OsWRKY71转录本和组蛋白H4乙酰化在RNAi中被诱导，表明HDT701作为植物防御的负调控因子，并通过乙酰化和去乙酰化过程调节WRKY基因的表达[43-44]。在稻瘟病抗性诱导中，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2 2个等位基因产生的抗性存在差异，插入1个编码为TE-siR815的内含子，在OsWRKY45-1的第一个内含子中，ST1基因被抑制，经导向RNA的DNA甲基化，ST1基因是WRKY45介导耐药的重要基因，这种突变导致抗病性表现为OsWRKY45-1的负作用和OsWRKY45-2的正作用[44-45]。

6 CRISPR/Cas9介导的WRKYs基因编辑

最新突破性的基因组编辑技术 （CRISPR）/Cas是一种簇状、有规则间隔的回文重复序列系统，已成为占主导地位的基因组编辑工具。CRISPR/Cas系统主要可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种类型，其中最简单和最常用的类型CRISPR/Cas9系统是脓毒链球菌的II型系统[46-48]。CRISPR/Cas9系统可引入包括碱基替换，插入突变和缺失突变等多种突变类型[49]。与之前的不同，CRISPR/Cas系统可以同时编辑多个基因在多个位点引起突变[50-54]。以CRISPR/Cas9系统介导的甘蓝型油菜基因组定向改变其基因型来探究。首先利用农杆菌介导的遗传转化技术构建针对甘蓝型油菜BnWRKY11和BnWRKY70基因的表达盒，构建Cas9、gRNA与Cas9形成复合物，使其转染到细胞，并引导酶切割目标DNA，与RNA通过互补序列结合，细胞试图修复DNA断裂，这就导致插入或删除，改变其阅读框，提前形成终止密码子，然后在T0代或T1代对目标位点进行扩增和测序，结果表明，BnWRKY70基因的过表达会降低对菌核病的抗性，利用CRISPR/Cas9系统可以在油菜甘蓝中产生多个同源突变植株，在定向改变基因中具有较高的编辑效率，可以在有限的世代内产生纯合突变体，所以表明可以利用其来提高油菜对病原菌的抗性[55]。

7 展望

近年来，随着研究发现WRKY转录因子家族演绎的角色逐步被解密，通过在染色体水平、基因分子水平上的分析研究，展示了WRKY所扮演的多元化调控角色，了解到WRKY转录因子的重要性，特别是在抗逆境生理胁迫中。可以从其各种角度，如WRKY的种类、功能作用、各种类相关联性、调控网络等，在植物育种方面的价值，挖掘出它更深刻的意义，提供更完善的WRKY转录因子家族的理论基础。

参考文献

[1] DODDS P N，RATHJEN J P.Plant immunity：Towards an integrated view of plant-pathogen interactions[J].Nat Rev Genet，2010，11：539-548.

[2] WEI T，OU B，LI J B，et al.Transcriptional profiling of rice early response to Magnaporthe oryzae Identified OsWRKYs as important regulators in rice blast resistance[J].PLoS One，2013，8（3）：1-14.

[3] KOORNNEEF A，LEONREYES A，RITSEMA T，et al.Kinetics of salicylatemediated suppression of jasmonate signaling reveal a role for redox modulation[J].Plant physiology，2008，147：1358-1368.

[4] RUSHTON P J，SOMSSICH I E，RINGLER P，et al.WRKY transcription factors[J].Trends Plant Sci，2010，15：247-258.

[5] YOKOTANI N，SATO Y，TANABE S，et al.WRKY76 is a rice transcriptional repressor playing opposite roles in blast disease resistance and cold stress tolerance[J].J Exp Bot，2013，64（16）：5085-5097.

[6] BAKSHI M，OELMLLER R.WRKY transcription factors：Jack of many trades in plants[J].Plant Signal Behav，2014，9：1-18.

[7] BRAND L H，FISCHER N M，HARTER K，et al.Elucidating the evolutionary conserved DNAbinding specificities of WRKY transcription factors by molecular dynamics and in vitro binding assays[J].Nucleic Acids Res，2013，41（21）：9764-9778.

[8] FRANCOZORRILLA J M，LPEZVIDRIERO I，CARRASCO J L，et al.DNAbinding specificities of plant transcription factors and their potential to define target genes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（6）：2367-2372.

[9] BAI Y L，SUNARTI S，KISSOUDIS C，et al.The role of tomato WRKY genes in plant responses to combined abiotic and biotic stresses[J].Frontiers in plant science，2018，9：801-807.

[10] 萬红建，俞锞，袁伟，等.番茄WRKY转录因子in silico鉴定及表达分析[J].分子植物育种，2013，11（1）：90-98.

[11] QIAN J，RIJIEPU A，ZHU B，et al.Outcomes of radical debridement versus no debridement for the treatment of thoracic and lumbar spinal tuberculosis[J].International orthopaedics，2016， 40（10）：2081-2088.

[12] YIN M L，WINGFIELD M J，ZHOU X D，et al.Multigene phylogenies and morphological characterization of five new Ophiostoma spp.associated with spruce-infesting bark beetles in China[J].Fungal biology，2016，120（4）：454-470.

[13]《海洋與湖沼》编辑部.《海洋与湖沼》2011年第6期论文导读[J].海洋科学，2012，36（3）：127-128.

[14] 王秀玲.棉花GhWRKY40基因的分离及其功能研究[D].泰安：山东农业大学，2014.

[15] 徐小艳，姚新转，吕立堂，等.烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析[J].植物生理学报，2018，54（6）：1085-1094.

[16] 祝一文，车永梅，赵方贵，等.碱胁迫下H2S参与活性氧代谢和水稻幼苗生长的调控[J].农业生物技术学报，2018，26（7）：1124-1131.

[17] 袁柳娇，傅梦妮，余如凤，等.秋茄（Kandelia candel L.）响应重金属胁迫的数字基因表达谱[J].东北林业大学学报，2017，45（2）：22-28.

[18] SETH C S，REMANS T，KEUNEN E，et al.Phytoextraction of toxic metals： A central role for glutathione[J].Plant Cell Environ，2012，35（2）：334-346.

[19] 肖俊.水稻WRKY13通过选择性结合不同顺式作用元件调控非生物和生物胁迫信号路径间的互作[D].武汉：华中农业大学，2013.

[20] 范荣伟，谢华，姚磊，等.大白菜BrWRKY33基因上游调控序列的克隆及其功能研究[J].农业生物技术学报，2010，18（4）：670-675.

[21] GRIMWOOD J，GORDON L A，OLSEN A，et al.The DNA sequence and biology of human chromosome 19[J].Nature，2004， 428：529-535.

[22] 姚海荣，曾炳山，范春节，等.巨桉EgrWRKY70基因克隆和初步表达分析[J].热带作物学报，2016，37（7）：1341-1348.

[23] 禹阳，贾赵东，马佩勇，等.WRKY转录因子在植物抗病反应中的功能研究进展[J].分子植物育种，2018，16（21）：7009-7020.

[24] CHEN C H，CHEN Z X.Potentiation of developmentally regulated plant defense response by AtWRKY18，a pathogeninduced Arabidopsis transcription factor[J].Plant physiology，2002，129（2）：706-716.

[25] KNOTH C，RINGLER J，DANGL J L，et al.Arabidopsis WRKY70 is required for full RPP4mediated disease resistance and basal defense Against Hyalperonospora parasitica[J].Molecular plantmicrobe interactions，2007，20（2）：120-128.

[26] LI J，BRADER G，PALVA E T.The WRKY70 transcription factor：A node of convergence for jasmonatemediated and salicylatemediated signals in plant defense[J].Plant cell，2004，16（2）：319-331.

[27] CHEN J，NOLAN T，YE H X，et al.Arabidopsis WRKY46，WRKY54 and WRKY70 transcription factors are involved in brassinosteroidregulated plant growth and drought response[J].The plant cell，2017，29：1425-1439.

[28] AERTS R J，GISI D，DE CAROLIS E，et al.Methyl jasmonate vapor increases the developmentally controlled synthesis of alkaloids in Catharanthus and Cinchona seedlings[J].The plant journal，1994，5（5）：635-643.

[29] VAN DER FITS L，MEMELINK J.ORCA3，a jasmonateresponsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism[J].Science，2000，289：295-297.

[30] 趙恒伟，葛锋，孙颖，等.植物萜类物质生物合成的相关转录因子及其应用前景[J].中草药， 2012，43（12）：2512-2519.

[31] BUER C S，IMIN N，DJORDJEVIC M A.Flavonoids： New roles for old molecules[J].J Integr Plant Biol，2010，52（1）：98-111.

[32] ECKARDT N A.Induction of phytoalexin biosynthesis： WRKY33 is a target of MAPK signaling[J].Plant cell，2011，23（4）：1190.

[33] QIU J L，FIIL B K，PETERSEN K，et al.Arabidopsis MAP kinase 4 regulates gene expression through transcription factor release in the nucleus[J].EMBO J，2008，27：2214-2221.

[34] HAGEL J M，FACCHINI P J.Benzylisoquinoline alkaloid metabolism：A century of discovery and a brave new world [J].Plant Cell Physiol，2013，54（5）：647-672.

[35] APUYA N R，PARK J H，ZHANG L P，et al.Enhancement of alkaloid production in opium and California poppy by transactivation using heterologous regulatory factors [J].Plant Biotechnol J，2008， 6（2）：160-175.

[36] 吴玲云，周波，李玉花.植物WRKY转录因子在脱落酸信号转导中的作用[J].分子植物育种，2014，12（2）：404-410.

[37] 张凡，尹俊龙，郭瑛琪，等. WRKY转录因子的研究进展[J].生物技术通报，2018，34（1）：40-48.

[38] JONAK C，KRSZ L，BGRE L，et al.Complexity，cross talk and integration of plant MAP kinase signalling[J].Curr Opin Plant Biol，2002，5（5）：415-424.

[39] VAN DE MORTEL J E，VILLANUEVA L A，SCHAT H，et al.Large expression differences in genes for iron and zinc homeostasis，stress response，and lignin biosynthesis distinguish roots of Arabidopsis thaliana and the related metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J].Plant Physiol，2006，142（3）：1127-1147.

[40] VAN DE MORTEL J E，SCHAT H，MOERLAND P D，et al.Expression differences for genes involved in lignin，glutathione and sulphate metabolism in response to cadmium in Arabidopsis thaliana and the related Zn/Cdhyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J].Plant Cell Environ，2008，31（3）：301-324.

[41] CHEN X S，ZHOU D X.Rice epigenomics and epigenetics： Challenges and opportunities[J].Curr Opin Plant Biol，2013，16（2）：164-169.

[42] HUANGFU J Y，LI J C，LI R，et al.The transcription factor OsWRKY45 negatively modulates the resistance of rice to the brown plant hopper Nilaparvata lugens[J].Int J Mol Sci，2016，17：1-14.

[43] GARG R，NARAYANA CHEVALA V，SHANKAR R，et al.Divergent DNA methylation patterns associated with gene expression in rice cultivars with contrasting drought and salinity stress response[J].Sci Rep，2015，5：1-16.

[44] XING M Q，ZHANG Y J，ZHOU S R，et al.Global analysis reveals the crucial roles of DNA methylation during rice seed development[J].Plant Physiol，2015，168：1417-1432.

[45] 陈思雀，翁群清，曹红瑞，等.WRKY转录因子在生物和非生物胁迫中的功能和调控机理的研究进展[J].农业生物技术学报，2017，25（4）：668-682.

[46] HARRISON M M，JENKINS B V，OCONNORGILES K M，et al.A CRISPR view of development[J].Genes Dev，2014，28：1859-1872.

[47] BARAKATE A，STEPHENS J.An overview of CRISPRbased tools and their improvements： New opportunities in understanding plantpathogen interactions for better crop protection[J].Front Plant Sci，2016，7：1-7.

[48] 王崧.TALEN的优化及其在干细胞中的应用[D].北京：中国科学院大学，2015.

[49] 魏新茹.靶向PSCA和MUC1的嵌合抗原受体T细胞治疗非小细胞肺癌的研究[D].合肥：中国科学技术大学，2017.

[50] JIANG W Z，YANG B，WEEKS D P.Efficient CRISPR/Cas9mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations[J].PLoS One，2014，9（6）：1-10.

[51] GAO J P，WANG G H，MA S Y，et al.CRISPR/Cas9mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J].Plant Mol Biol，2015，87：99-110.

[52] NAKAYAMA T，FISH M B，FISHER M，et al.Simple and efficient CRISPR/Cas9mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis[J].Genesis，2013，51（12）：835-843.

[53] RON M，KAJALA K，PAULUZZI G，et al.Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes as a tool for exploring cell typespecific gene expression and function using tomato as a model[J].Plant Physiol，2014，166：455-469.

[54] 馮璇.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向改良水稻两个品质性状[D].南宁：广西大学，2017.

[55] SUN Q F，LIN L，LIU D X，et al.CRISPR/Cas9mediated multiplex genome editing of the BnWRKY11 and BnWRKY70 genes in Brassica napus L.[J].Int J Mol Sci，2018，19：1-19.