高 霞, 潘会宾, 乔成芳, 陈凤英, 周 元, 杨文华

(1. 商洛学院化学工程与现代材料学院, 陕西省尾矿资源综合利用重点实验室, 商洛 726000;2. 陕西师范大学化学化工学院, 大分子科学陕西省重点实验室, 西安 710119;3. 商洛职业技术学院公共基础教学部, 商洛726000)

染料废水具有成分复杂、有机物浓度和色度高及难生化降解等特点, 是难处理的工业废水之一. 处理染料废水的常用方法有生物法、吸附法、萃取法和化学法等[1～7]. 有机染料对水中生物具有致畸、致癌和致突变作用, 危害水中鱼类等各种生物的生存. 此外还会对人体造成严重损害, 如导致人体肾脏、生殖系统、肝脏、大脑和中枢神经的功能性障碍[8～10]. 因此染料废水的降解一直是研究热点, 大多数染料因毒性强、种类多、色度大等性质, 不仅有诱发人类癌症的可能, 且给环境保护造成极大的威胁. 酶具有高效的催化活性, 同时兼具良好的特异性、反应条件温和、来源广泛及绿色环保等优点, 因此酶催化降解染料具有一定的应用前景[11～14]. 然而, 游离酶在高温、强酸、强碱及有机溶剂中容易失活及反应后分离纯化困难, 难以回收重复利用, 而使用固定化酶可以使催化剂与产物得以分离, 实现酶的循环重复使用. 固定化酶一个最大的用途就是处理工业废水中的有毒物质, 防止水体污染. 利用固定化过氧化物酶的催化氧化作用来处理酚类、芳香胺类、染料类废水的污染是近年来受到重视的新方法, 降解的结果有效地降低了有毒有机污染物的含量和毒性, 是一种有效的废水处理方法[11,12,15～19].

在固定化酶载体选择方面, 金属有机骨架(MOFs)材料由于具有较大的比表面积、孔道可调控性以及孔径分布的均一稳定性等优良特性而成为理想的固定化酶载体. 近年来, 人们对MOFs材料在酶固定化中的应用进行了研究, 并取得了一定的成果[20～26]. Kim等[20]将采用水热处理后合成法得到的一种新型微孔MOF[POST-66(Y)]进行水热处理得到的多级孔MOFs分别对维生素B12(VB12), 细胞色素C(Cyt C), 肌红蛋白(Myoglobin)和辣根过氧化物酶(HRP)4种酶进行固定化, 固定后的酶表现出良好的稳定性和重复使用性. Ding等[21]采用模板法制备得到了一种具有双级孔结构(3.5和7 nm)的新型Zr-MOF(MMU)材料, 采用物理吸附法实现对漆酶的固定, 固定化酶具有较高的稳定性, 重复使用10次后还能保持50%的初始活力, 在水相中储存21 d后仍保留55.4%的初始活力, 可作为一种新型材料应用于固定化酶领域.

本文采用自组装模板法制备了多级孔Zr-MOF材料, 以多级孔Zr-MOF材料为载体, 采用吸附法固载辣根过氧化物酶(HRP), 以染料结晶紫的催化降解脱色反应为模型反应考察了酶的催化活性, 探讨了游离酶及其固定化酶反应器的操作稳定性, 并考察了其实际应用情况.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

HRP(纯度≥95%)购于北京索莱宝科技有限公司; 对苯二甲酸(H2BDC, 纯度99%)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 纯度>99.5%)购于梯希爱化成工业发展有限公司; 四氯化锆(ZrCl4, 纯度99%)和苯甲酸(HBC, 纯度99%)购于Sigma-Aldrich公司; 乙酸铜和30%(质量分数)过氧化氢均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司; 无水乙醇(分析纯)购于天津化学试剂厂; 结晶紫(纯度99%)购于天津市福晨化学试剂厂.

D/Max-3C型全自动X射线衍射仪(XRD, 日本Rigalcu公司); UV-1700型紫外-可见分光光度计(岛津国际贸易上海有限公司); ASAP 2460系列物理吸附仪(美国麦克公司); FV1200型激光共聚焦显微镜(CLSM, 日本奥林巴斯公司); SU8220型场发射扫描电子显微镜(FESEM, 日本Rigalcu公司); JEM-2100型透射电子显微镜(TEM, 日本电子公司).

1.2 实验过程

1.2.1 多级孔Zr-MOF的制备 将0.120 g ZrCl4、0.166 g对苯二甲酸、一定质量的HBC(5, 10或15 mmol)、0.181 g乙酸铜和10 mL DMF置于20 mL内衬为聚四氟乙烯的水热反应釜中, 超声30 min, 密封后在5 h内升温至120 ℃, 恒温72 h, 然后缓慢冷却至室温, 产物依次用DMF和丙酮多次洗涤, 得到白色复合物(含模板剂的Zr-MOF材料), 向复合物中加入5 mL HCl溶液(0.1 mol/L), 置于恒温振荡器振荡10 min以除去动态模板剂; 离心, 除去上清液后用丙酮洗涤多次, 于60 ℃真空干燥12 h, 即可得到多级孔Zr-MOF载体材料. 通过改变孔径调节剂HBC的用量, 可得到不同孔径的样品, 并分别标为Zr-MOF-1, Zr-MOF-2和Zr-MOF-3.

1.2.2 HRP@Zr-MOF的制备 将50 mg多级孔Zr-MOF载体材料置于150 ℃真空中活化12 h, 备用. 将5 mg活化后的多级孔Zr-MOF载体材料加入pH值为2.5～5.0的0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和150 μL 10 mg/mL HRP溶液中, 体系总体积为1.5 mL. 混合均匀后, 于恒温振荡器中以200 r/min的转速振荡20～120 min, 再将混合物以6000 r/min的转速离心5 min, 分离上清液与固体, 并用醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤除去载体表面游离的HRP, 于30 ℃真空干燥12 h得到多级孔Zr-MOF固定化HRP, 标记为HRP@Zr-MOF. 采用紫外分光光度计测定上清液中残留HRP的浓度进而计算酶的固载量, 固载量(mg/g)的计算公式为

(1)

式中: ΔA为HRP在紫外波长403 nm处的吸光度值变化;V(mL)为实验体系的最终体积;ε(102000 L·mol-1·cm-1)为HRP的摩尔吸光系数;l(cm)为实验中所用比色皿的宽度;m(g)为加入Zr-MOF的质量.

保持固定化条件不变, 分别考察固定化时间(20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 min)、pH值(2.5, 2.75, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0)和固定化温度(20, 25, 30, 35, 40 ℃)等因素对Zr-MOF对HRP固载量的影响, 从而确定其固定化的最优条件.

1.2.3 HRP催化降解结晶紫脱色反应 向2 mL用铝箔裹住的离心管中加入一定体积0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液, 然后加入一定量的游离HRP或HRP@Zr-MOF(5 mg载体固载HRP的量)和75 μL 10 mmol/L结晶紫溶液, 再向反应体系中加入一定体积H2O2溶液, 保持最终体积为1.5 mL. 室温下避光反应5 min后离心. 采用紫外分光光度计测定降解前后的结晶紫在紫外特征吸收波长(584 nm)处的吸光度值, 并计算染料的降解率(η, %):

(2)

式中:A0和At分别为染料降解前后在584 nm处的吸光度值.

1.2.4 热稳定性和储存稳定性测定 将30 μL 10 mg/mL的游离HRP与含等量HRP的HRP@Zr-MOF加入到一定体积的0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中, 并置于20～100 ℃温度下温育0～180 min, 再将温育过的游离HRP和HRP@Zr-MOF用于结晶紫催化降解反应, 比较游离HRP和HRP@Zr-MOF的热稳定性.

将30 μL 10 mg/mL的游离HRP及含等量HRP的HRP@Zr-MOF储存在室温下持续56 d, 每7 d用结晶紫催化降解反应的降解率来表征其催化活性, 定义最初反应的催化活性为100%, 其它时间的降解率与之比较来计算酶的相对活性.

1.2.5 重复使用性测定 将HRP@Zr-MOF用于结晶紫催化降解反应, 完成一次催化反应后, 经离心分离并用醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤, 继续用于后续催化反应, 将第一次使用HRP@Zr-MOF的催化活性记作100%, 之后每次的催化活性与第一次进行比较, 以残余催化活性表征HRP@Zr-MOF的重复使用性.

2 结果与讨论

2.1 HRP@Zr-MOF的设计构筑策略

采用自组装模板法, 选择不稳定的Cu-MOF为模板剂, HBC为孔径调节剂, 设计得到3种孔径的Zr-MOF材料. 将它们作为固相载体, 利用物理吸附法固载HRP. 以结晶紫的催化降解反应为模型考察了3种固定化酶反应器的催化活性, 结果表明, 载体孔径对固定化酶反应器的催化活性有较大影响. 由表1可以看出, 3种Zr-MOF材料的平均孔径分别为4.2, 8.6和12.8 nm, 其中Zr-MOF-2材料具有相对较高的酶催化活性. 根据文献[20]报道, 游离HRP的分子尺寸为4.0 nm×4.4 nm×6.8 nm. 以上结果表明, 游离HRP分子难以进入到Zr-MOF-1材料孔道中. 此外, 还要求MOF的孔径足够大, 为酶分子提供一个翻转空间来发挥催化作用. 由于Zr-MOF-1不适合固载HRP, 而Zr-MOF-2的孔道可以提供足够的空间来容纳HRP以及进行催化过程. 进一步扩大Zr-MOF孔径至12.8 nm时, 酶反应器的催化活性略有降低, 推测可能的原因是随着材料孔径的增大, 固载到孔道中的酶分子增多, 由于介孔孔道的限域效应会导致酶分子发生团聚, 从而使底物的扩散阻力增大, 酶催化活性降低. 因此, 选择Zr-MOF-2作为HRP固定化的载体. 此外, 由于介孔孔道的限域效应, 可以推测出Zr-MOF-2中HRP是以“酶的单阵列方式包埋”的方式存在于一个孔道中, 这样就可以避免酶分子的团聚和催化活性的损失.

Table 1 Pore sizes of Zr-MOF and catalytic activity of HRP@Zr-MOF

2.2 Zr-MOF固定化HRP条件的优化

图1为Zr-MOF固定化HRP过程中醋酸-醋酸钠缓冲液pH值、固定化时间及温度对固定效果的影响结果. 由图1(A)可见, 缓冲液pH值分别设定为2.5, 2.75, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5和5.0时, 固定化最适pH值在3.0左右; 由图1(B)可见, 将反应时间依次设定为20, 30, 40, 50, 60, 90和120 min时, 60 min后酶的固载量基本不变, 可能与物理吸附法固定化酶达到吸附平衡有关, 所以最佳固定化时间为60 min; 由图1(C)可见, 将反应温度依次设定为20, 25, 30, 35和40 ℃时, 酶的固载量先增大后减小, 这可能是因为温度过高吸附后酶分子脱附而影响固载量, 所以最佳固定化温度为30 ℃. 综上所述, 以多级孔Zr-MOF为载体, 固定化HRP的最佳固定化条件: pH=3.0、固定化时间60 min、固定化温度30 ℃, 固载量最高可达61.6 mg/g.

Fig.1 Effects of the pH values(A), time(B) and temperatures(C) on the immobilization of HRP with Zr-MOF

下面以Zr-MOF-2为载体, 在最佳固定化条件下, 讨论Zr-MOF和HRP@Zr-MOF的形貌结构以及HRP@Zr-MOF的染料降解催化性能.

2.3 多级孔Zr-MOF及其HRP@Zr-MOF的结构表征

2.3.1 N2吸附-脱附分析 将制备的3种Zr-MOF材料于150 ℃下脱气12 h后, 在液氮温度(77 K)下进行氮气吸附-脱附测试, 图2(A)为3种Zr-MOF材料的氮气吸附-脱附曲线, 图2(B)为采用BJH模型计算得到的材料孔径分布曲线. 如图2(A)所示, 3种Zr-MOF材料的氮气吸附-脱附曲线具有较明显的第Ⅳ类等温线特征, 属于典型的介孔固体材料的吸附, 存在滞后环, 表明材料具有介孔结构. 由表1和图2(B)可见, 3种Zr-MOF材料均含有3类大小不同的孔道. 根据已有文献[21]报道, 结合氮气吸附-脱附测试结果, 进一步表明所制备的材料为多级孔材料.

Fig.2 N2 adsorption-desorption isotherms(A) and pore size distributions(B) of Zr-MOF

Fig.3 PXRD patterns of Zr-MOF(a), Zr-MOF after activation(b) and simulate UiO-66(c)(A)and PXRD patterns of Zr-MOF after activation(a) and HRP@Zr-MOF(b)(B)

2.3.2 X射线粉末衍射(PXRD)分析 图3(A)为多级孔Zr-MOF材料活化前后以及UiO-66的PXRD谱图. 可见, 多级孔Zr-MOF材料活化前后的特征衍射峰一致, 证明多级孔Zr-MOF材料经活化后仍能保持很好的结构完整性, 骨架未发生坍塌. 多级孔Zr-MOF材料与UiO-66的特征衍射峰基本吻合, 表明此类材料属于UiO-66系列材料. 为了进一步研究HRP的存在对多级孔Zr-MOF结构造成的影响, 通过PXRD对HRP@Zr-MOF(固定化条件: pH=3.0、固定化时间60 min、温度30 ℃)进行了表征[见图3(B)]. 可见, HRP@Zr-MOF仍呈现出UiO-66的2个特征衍射峰(2θ=7.3°, 8.5°), 由此表明HRP的引入不会对多级孔Zr-MOF的结构造成影响.

2.3.3 FESEM和TEM分析 对Zr-MOF载体及其HRP@Zr-MOF固定化酶反应器进行了FESEM和TEM测试, 结果分别见图4和图5. 由图4可见, Zr-MOF的尺寸及形貌与HRP@Zr-MOF的基本类似, 均呈现直径约为80 nm尺寸均一的六边形纳米结构. 由酶固定化前后材料形貌(图5)对比可知, 固定化酶后的Zr-MOF材料上粒子数目明显增多. 由此可知, 酶分子已经固定在Zr-MOF材料上, 且Zr-MOF材料的形貌几乎未改变, 进一步说明酶分子的引入未改变Zr-MOF材料的结构.

Fig.4 FESEM images of Zr-MOF(A) and HRP@Zr-MOF(B)

Fig.5 TEM images of Zr-MOF(A) and HRP@Zr-MOF(B)

2.3.4 CLSM分析 将用异硫氰酸荧光素(FITC)标记HRP制备的FITC-HRP@Zr-MOF用于激光共聚焦显微镜测试, 图6(A)为Zr-MOF材料的激光共聚焦显微镜照片, 图6(B)为引入Zr-MOF的FITC-HRP的激光共聚焦显微镜照片, 图6(C)为图6(A)和(B)的叠加图. 图6(B)和(C)中可见许多均匀分布的绿色荧光斑点, 由于Zr-MOF材料不是荧光材料, 通过观察得知图6(A)中确实没有出现绿色荧光斑点, 因此所观察到的荧光信号来自于引入Zr-MOF的FITC-HRP. 以上实验结果表明HRP被固载到了Zr-MOF材料的整体骨架结构中.

Fig.6 Laser confocal microscopy images of the Zr-MOF(A) and FITC-HRP@Zr-MOF(B,C)

Fig.7 UV-Vis absorbance spectra of oxidation degradation of crystal violet catalyzed by free HRP and HRP@Zr-MOF

2.4 HRP@Zr-MOF的催化活性

通常, 造成固定化酶反应器催化活性降低或损失主要有2个原因: 酶与载体之间的相互作用使得酶分子表面氨基酸残基的构象以及活性位点的微环境发生改变, 从而导致酶催化活性的降低; 底物在固相载体中的传质阻力相对于在溶液本体中会增大. 图7给出了利用酶催化降解结晶紫脱色反应来表征游离HRP和HRP@Zr-MOF的催化活性. 可见, 与游离HRP相比, HRP@Zr-MOF可以保留96.8%的催化活性. HRP@Zr-MOF之所以能保持较高的催化活性是由于Zr-MOF载体自身的多级孔结构优势, 其介孔孔径(8.6 nm)可以与游离HRP(4.4 nm×4.4 nm×6.8 nm)的尺寸相匹配, 底物可以富集在固载酶分子的介孔周围的微孔中, 从而使其传质阻力减小. 此外, 由介孔孔道的限域效应可以推测出在Zr-MOF中酶分子是以单阵列的方式包埋于通道中, 从而避免了酶分子的团聚.

2.5 HRP@Zr-MOF的操作稳定性

2.5.1 HRP@Zr-MOF的热稳定性 由于温度对酶催化反应的速率有很大的影响, 因此限制了酶在工业生产中的实际运用. 升高温度, 酶催化反应速率会增大, 然而超过酶催化反应的最适温度后, 升温会破坏酶的三维结构, 导致催化活性的降低. 图8(A)给出了游离HRP和HRP@Zr-MOF在20～100 ℃条件下温育1 h的热稳定性. 可见, 随着温度的升高, 游离HRP和HRP@Zr-MOF催化结晶紫染料脱色反应的催化活性呈“钟罩型”变化, 游离HRP的最佳反应温度在40 ℃左右, 超过50 ℃后催化活性明显下降. HRP@Zr-MOF在50 ℃左右催化活性最高, 并且在较高温度下仍保持了较高的催化活性, 如70 ℃时, HRP@Zr-MOF仍能保持接近80%的催化活性, 游离HRP几乎失去全部活性. 图8(B)给出了游离HRP和HRP@Zr-MOF在60 ℃条件下温育0～3 h的热稳定性. 可见, 随着温育时间的延长, 游离HRP和HRP@Zr-MOF的催化活性均下降, 温育3 h后, HRP@Zr-MOF仍能保持90.2%的催化活性, 而游离HRP仅能保持29.5%的催化活性. 以上结果表明, HRP@Zr-MOF的热稳定性较游离HRP显著提高, 这是由于Zr-MOF骨架结构具有较高的热稳定性, 可为包埋于其中的酶分子提供刚性屏蔽环境, 限制了酶分子在高温下的伸展和特异性聚集, 从而提高了酶的热稳定性[27].

Fig.8 Temperature stability of free HRP and HRP@Zr-MOF

Fig.9 Effects of pH values on the catalytic activity of free HRP and HRP@Zr-MOF

2.5.2 HRP@Zr-MOF的酸碱稳定性 酶由蛋白质组成, 其催化能力对外部环境特别是pH值非常敏感, pH值过高或过低, 一方面会破坏酶的三维结构, 造成酶蛋白分子变性失活; 另一方面会导致酶分子表面存在的氨基酸残基侧链上的基团发生解离, 造成底物无法与酶蛋白结合或底物不能被酶分解为产物. 图9给出了反应体系的pH值对染料结晶紫催化降解的影响. 由图9可知, 反应体系的pH值对染料结晶紫的催化降解影响很大. 在pH=2.5～6.0时, 酶催化降解染料的降解率随pH值的增加呈先增大后减小的趋势, 结晶紫的最佳降解pH值约为5.0. 当pH值>5.0时, 游离HRP和HRP@Zr-MOF对结晶紫的降解率均呈下降趋势, 但在相同pH值条件下, HRP@Zr-MOF的催化效率总是高于游离HRP, 这说明Zr-MOF的孔道骨架能够为HRP提供良好的屏蔽场所, 减少了pH值对游离HRP残基侧链基团解离状态的影响, HRP@Zr-MOF固定化酶反应器具有更好的耐受酸碱环境的优势.

2.5.3 HRP@Zr-MOF对H2O2的稳定性 H2O2是HRP催化氧化反应中一种重要的氧化剂, 但高浓度的H2O2不利于酶分子中亚铁血红素的催化反应, 主要是由于酶的活性中心卟啉环的破坏导致酶分子失活[28]. 图10给出了反应体系中H2O2浓度对染料结晶紫催化降解的影响. 可见, 染料结晶紫催化降解的最佳H2O2浓度为0.3 mmol/L. 当H2O2浓度小于0.3 mmol/L时, 游离HRP和HRP@Zr-MOF对结晶紫的降解率相差不大, 游离HRP甚至比HRP@Zr-MOF更有优势, 但当H2O2浓度大于0.3 mmol/L后, 游离HRP的降解率下降明显, 而HRP@Zr-MOF的降解率下降较为缓慢, 表明HRP@Zr-MOF对高浓度的H2O2有较好的抵抗力.

Fig.10 Effects of H2O2 concentration on the catalytic activity of free HRP and HRP@Zr-MOF

Fig.11 Storage stability of free HRP and HRP@Zr-MOF

2.5.4 HRP@Zr-MOF的储存稳定性 图11为游离HRP及其HRP@Zr-MOF在室温条件下的储存稳定性曲线. 可见, HRP@Zr-MOF的储存稳定性明显优于游离HRP. 在室温下保存56 d后, 游离HRP仅能保持不到30.0%的催化活性, 而HRP@Zr-MOF仍能保持85.6%的催化活性. 结果表明, 游离HRP固载之后形成的酶反应器的储存稳定性较游离酶显著提高, 在室温下就能保存较长的时间, 这是由于游离HRP固载之后, 酶活性中心表面的微环境发生了变化, 酶的结构更加稳定, 减少了外界环境对酶活性的影响, 使得酶在室温下仍能较好的保持其催化活性[29].

2.6 HRP@Zr-MOF的重复使用性

游离酶难以从反应体系中分离出来重复使用, 将其固载到固相载体中后, 就可以通过固液分离实现酶的重复使用, 大大降低生产成本, 并可以在实际工业生产中得到应用[30]. 图12为HRP@Zr-MOF在结晶紫脱色降解反应中的重复使用情况. 可见, 随着重复使用次数的增加, HRP@Zr-MOF的催化活性缓慢下降, 在重复使用10次后仍能保持62.3%的催化活性. 介孔MOF(Tb-TATB)固定化酶反应器[31]在重复使用7次后, 仅能保持53.0%的催化活性; MOF固定化葡萄糖淀粉酶反应器[32]在重复使用6次后, 仅能保持57.0%的催化活性. 与上述文献结果相比, 本文制备的HRP@Zr-MOF酶反应器具有相对较好的重复使用性, 这主要源于Zr-MOF属于一种高稳定的多级孔MOF材料, 其被用于固载酶除了具有MOFs材料自身的优点外, 还具有多级孔结构和水溶液高稳定性两大优势.

Fig.12 Operational reusability of HRP@Zr-MOF

Fig.13 Decolorization of crystal violet with HRP@Zr-MOF in actual wastewater

2.7 HRP@Zr-MOF在染料降解中的应用研究

为了考察HRP@Zr-MOF催化降解结晶紫染料的实际应用能力, 选取了西安市周边秦镇水、沣峪水、黑河水和人工湖4种水源作为实验水样, 选用相同条件下的醋酸-醋酸钠缓冲液作为对照样, 向水样和对照样中加入等量的结晶紫染料, 分别用HRP@Zr-MOF催化结晶紫脱色, 结果见图13. 可见, HRP@Zr-MOF对秦镇水、沣峪水、黑河水和人工湖实验水样中结晶紫的降解率均在5 min内达到90%以上, 且其对实验水样中结晶紫的催化效率较对缓冲液中略低, 可能是由于实际水样中存在的多种金属离子或微生物等会对HRP的催化活性产生影响. 以上结果表明, HRP@Zr-MOF可在自然水源中应用于催化结晶紫染料降解反应体系, 此类固定化酶反应器作为一种绿色的固体催化剂在染料废水的处理方面具有极为广阔的应用前景.

3 结 论

采用自组装模板法制备多级孔Zr-MOF, 并将HRP固载到多级孔Zr-MOF中构筑HRP@Zr-MOF酶反应器. 通过N2吸附-脱附分析、XRD、FESEM、TEM及CLSM等表征结果证实已成功制备了多级孔Zr-MOF载体, 且游离HRP被成功固载到Zr-MOF的孔道中, 而并非表面吸附. HRP@Zr-MOF固定化酶反应器表现出比游离酶更优异的热稳定性、酸碱稳定性、H2O2稳定性及储存稳定性; 重复使用10次后, HRP@Zr-MOF的相对活性仍能保持62.3%. HRP@Zr-MOF用于催化降解结晶紫染料具有反应时间较短、酶用量少、反应条件温和等优点, 在5 min内降解率高达90%以上, 适合应用于实际染料降解体系中.