崔兰凤 徐红日 王玉婷 赵世同 王成祥

摘要  目的：观察扶正解毒化瘀方对脂多糖诱导的大鼠肺巨噬细胞中NLRP3炎性体通路及相关炎性反应递质的作用。方法：将大鼠NR8383细胞分为空白组、模型组、扶正解毒化瘀方组、哌拉西林他唑巴坦（TZP）组以及中药+TZP组。用制备扶正解毒化瘀方中药原液作用于脂多糖诱导的大鼠NR8383细胞，采用qPCR和Western blotting分别检测NLRP3炎性体通路的mRNA表达和蛋白水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测干预前后炎性反应递质的水平。结果：扶正解毒化瘀方组和TZP组均能明显降低NLRP3、Caspase-1和ASC的mRNA表达，2组NLRP3和ASC的蛋白水平明显下降，Caspase-1和IL-1β蛋白水平也有下降趋势。扶正解毒化瘀方组和TZP组均能明显降低IL-18和IL-1β炎性反应递质水平，联合用药有增效作用。结论：扶正解毒化瘀方对NLRP3炎性体作用明确，可能通过NLRP3炎性体通路延缓机体免疫炎性损伤。

关键词  扶正解毒化瘀方;多重耐药铜绿假单胞菌;NLRP3炎性体;固有免疫;脂多糖

Study on Regulatory Effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on Lung Macrophages Induced by LPS in Rats

CUI Lanfeng1，XU Hongri1，WANG Yuting2，ZHAO Shitong2，WANG Chengxiang1

（1 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Abstract Objective： To observe the effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the NLRP3 inflammasome pathway and related inflammatory factors in rats′ lung macrophages induced by LPS. Methods： Original liquid of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction was prepared and applied on LPS-induced NR8383 rat cells.They were divided into blank group，model group，Fuzheng Jiedu Huayu Decoction group，piperacillin-tazobactam（TZP）group and combination group.The qPCR and western-blot were used to detect the expression of mRNA and protein level of the NLRP3 inflammasome pathway，respectively.ELISA was used to detect levels of inflammatory factors before and after the intervention. Results： Both Fuzheng Jiedu Huayu Decoction and TZP could significantly reduce the mRNA expressions of NLRP3，Caspase-1 and ASC.The protein levels of NLRP3 and ASC in the 2 groups were decreased significantly.The protein levels of Caspase-1 and IL-1β also showed a decreasing trend.Both Fuzheng Jiedu Huayu Decoction and TZP could significantly reduce the levels of IL-18 and IL-1β inflammatory factors.And the combination of drugs produced a synergistic effect. Conclusion： Fuzheng Jiedu Huayu Decoction has a certain effect on NLRP3 inflammasome，which may delay immune inflammatory injury of the body through the NLRP3 inflammasome pathway.

Keywords  Fuzheng Jiedu Huayu Decoction; Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa（MDRPA）; NLRP3 inflammasome; Innate immunity; LPS

中圖分类号：R254;R289.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.012

老年人基础疾病较多，机体免疫功能低下，是老年人易发生细菌耐药的关键[1]。耐药菌感染致病菌以革兰阴性杆菌为主，尤以铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）多见。耐药PA感染显著增加ICU患者的死亡率，数据表明，13% ～18%的患者死因归于敏感PA感染，而54.4%的死亡与多重耐药铜绿假单胞菌（Multiple-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa，MDRPA）感染有关[2]。PA感染可以激活机体固有免疫系统的TLRs、NODs等受体，促发炎性级联反应而引起免疫炎性损伤。PA引起肺部感染的毒力因子众多，其中通过分泌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等不同方式与TLRs或NODs结合从而激发免疫炎性反应是主要的致病机制[3-4]。同时，NOD2参与PA感染致机体免疫炎性损伤的过程与TLR4/NF-κB通路联系紧密[5]。NLRP3炎性体是NOD2的典型代表，NF-κB、TNF-α、IL-1β能够引起NLRP3炎性体的表达，促进半胱天冬酶-1（Caspase-1）的活化[6]。活化的Caspase-1促进IL-1β或IL-18的成熟和释放，引起机体的炎性反应。

老年人肺炎属于老年风温肺热病范畴，王成祥教授认为其基本病机为“正气亏虚，毒瘀互结”[7]。据此核心病机设立的扶正解毒化瘀方由西洋参、黄芩、连翘、漏芦、败酱草、赤芍、瓜蒌、生薏苡仁组成，“十一五”国家科技支撑计划项目表明，与标准抗感染治疗比较，联合扶正解毒化瘀方能够改善病程达2周以上老年患者的肺部影像学征象，并减轻临床症状[8-9]。同时，扶正解毒化瘀方能够通过敏化抗菌药物和破坏细菌细胞壁，降低PA的耐药性，并且可减少IL-1β的分泌，降低PA诱导的炎性损伤。本课题组已从TLRs胞外识别系统的角度，探索了扶正解毒化瘀方延缓免疫炎性损伤的机制。本研究从该方对NLRP3炎性体通路及有关细胞因子的影响入手，观察其对NODs胞内识别系统的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 大鼠NR8383细胞（上海中乔新舟Cat.ZQ0142），用含20%的胎牛血清的F12培养基于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.1.2 药物

扶正解毒化瘀方由黄芩、连翘、漏芦、赤芍、瓜蒌、西洋参、败酱草和生薏苡仁组成，以上药物由北京康仁堂药业有限公司制备成颗粒剂。中药原液制备：使用去离子水配制，浓度为1.56 g/mL，过滤后4 ℃保存。对照组使用注射用哌拉西林他唑巴坦钠（TZP）（惠氏，AKGD/11）。

1.1.3 试剂与仪器

F12基础培养基（中乔新舟，ZQ400），FBS胎牛血清（Gibco，10099133），IL-1β（成志科为，Su-B30206）及IL-18 ELISA试剂盒（成志科为，Su-B30204）;NLRP3兔抗（博士德生物，BM4490）、ASC兔抗（正能生物，340097）、Caspase-1兔抗（Gibco，Ab109362）和IL-1β兔抗（Gibco，ab9722）;生物倒置显微镜（日本OLYMPUS，CKX41）、细胞培养箱（Thermo Fisher，HERAcell 150i）、离心机（Thermo Fisher，ST16）、荧光定量PCR仪（ABI，7500）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

使用F12培养基（胎牛血清含量20%），于37 ℃、CO2含量5%的培养箱中培养NR8383细胞。倒置显微镜下观察细胞生长，每隔2～3 d换液。待培养瓶中细胞生长到80%左右，收集细胞并转移至无菌离心管，离心4 min，（1 000 r/min）弃上清，并转移至新的无菌培养瓶中培养，比例为1∶ 3。收集对数生长期细胞，在完全培养基中重新悬浮，调整浓度至1×105细胞/mL，随后接种至6孔板中，每孔2 mL。依干预措施不同，分为空白组、模型组、扶正解毒化瘀方组、哌拉西林他唑巴坦（TZP）组以及中药+TZP组。

1.2.2 干预方法

空白组以含胎牛血清（FBS）的F12培养基继续培养;模型组则加入终浓度为10 μg/mL的LPS;扶正解毒化瘀方组中加入扶正解毒化瘀方原液以及终浓度10 μg/mL的LPS;哌拉西林他唑巴坦（TZP）组加入4.5 μg/mL的哌拉西林他唑巴坦钠（TZP）溶液以及终浓度为10 μg/mL的LPS;联合用药组加入终浓度为10 μg/mL的LPS、中药原液及4.5 μg/mL的TZP。继续培养48 h，离心，收集细胞上清及沉淀，分别用于酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子和qPCR及Western-blot实验。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 qPCR检测NLRP3炎性体各因子的mRNA表达水平

通过qPCR检测NLRP3、Caspase-1等mRNA表达水平，引物序列见表1。

取上述方法处理的细胞沉淀，提取总RNA。75%乙醇洗涤后，加入20 μL无RNA酶的水溶解RNA，进行逆转录反应。配制反应体系：、PCR上游引物2.0 μL、PCR下游引物2.0 μL、cDNA 2.0 μL、50×Rox参比染料0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。PCR扩增条件：预变性，95 ℃ 10 min，1个循环;95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，40个循环。循环结束后温度升高至95 ℃获取熔解曲线。

1.2.3.2 Western blotting检测NLRP3炎性体蛋白表达

裂解细胞，收集总蛋白溶液，通过BCA法测定样品蛋白浓度。按照4：1的比例加入5×SDS上样缓冲液并混匀，置于沸水中5 min后立即置于冰上3 min。电泳：10% SDS-PAGE凝胶电泳（浓缩胶电压75 V，分离胶电压120 V），至溴酚蓝刚跑出时终止;200 mA条件下转膜1 h。免疫反应：将转好的膜于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h;稀釋一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA），4 ℃过夜;TBST清洗3次，每次5 min脱色;5%脱脂牛奶稀释二抗，室温孵育30 min。暗室曝光、显影、定影。Image J软件获取图像、处理分析目标带的吸光度A值。

1.2.3.3 ELISA检测炎性反应递质水平

设置标准品孔、样本孔及空白孔。标准品孔加入不同浓度的标准品50 μL，样本孔加入待测样本50 μL，之后各孔加入辣根过氧化物酶标记的抗体100 μL，封孔，37 ℃孵育60 min。重复洗涤5次后，每孔加入底物50 μL，37 ℃避光孵育15 min。加入终止液50 μL，15 min内于450 nm波长处测定各孔A值。将标准品及样本值减去空白孔数值后绘制曲线。以标准品浓度为横坐标，A450数值为纵坐标，使用ELISACalc软件制作标准曲线，计算样品浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（  ±s ）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，方差不齐时，使用方差单变量分析。以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qPCR检测NLRP3炎性体mRNA水平

与空白组比较，模型组NLRP3、Caspase-1以及ASC的mRNA水平明显升高。与模型组比较，扶正解毒化瘀方组和TZP组NLRP3的mRNA水平明显降低（ P <0.05），但中药和TZP作用差异无统计学意义（ P =0.173），中药+TZP组优于扶正解毒化瘀方组或TZP组（ P <0.05）。模型组ASC表达明显升高，扶正解毒化瘀方组和TZP组较模型组明显降低（ P <0.05），但扶正解毒化瘀方组和TZP组作用差异无统计学意义（ P =0.223），中药+TZP组优于扶正解毒化瘀方组或TZP组，差异有统计学意义（ P <0.05）。TZP组对Caspaes-1的作用优于扶正解毒化瘀方组（ P <0.05），中药+TZP组优于扶正解毒化瘀方组或TZP组，差异有统计学意义（ P <0.05）。见图1和图2。

模型组IL-1β mRNA表达明显升高，扶正解毒化瘀方组能够降低IL-1β的mRNA水平，但差异无统计学意义（ P >0.05）。TZP组及中药+TZP组IL-1β的表达较模型组降低（ P <0.05），且中药+TZP组优于扶正解毒化瘀方组（ P =0.024），但与TZP组差异无统计学意义（ P =0.608）。见图2。

2.2 Western-blot检测NLRP3炎性体蛋白水平

与空白组比较，模型组NLRP3蛋白水平明显升高（ P <0.05）。扶正解毒化瘀方组和TZP组较模型组NLRP3蛋白水平降低，但差异无统计学意义（ P >0.05），扶正解毒化瘀方+TZP组则能明显降低NLRP3水平（ P =0.014）。模型组ASC水平明显升高（ P <0.05），扶正解毒化瘀方组、TZP组以及扶正解毒化瘀方+TZP组均能降低ASC蛋白水平，差异有统计学意义（ P <0.05），但3组相互之间作用差异无统计学意义（ P >0.05）。模型组Caspase-1和IL-1β蛋白水平有所升高，扶正解毒化瘀方组、TZP组以及扶正解毒化瘀方+TZP组均能降低Caspase-1和IL-1β的蛋白水平，但各组差异无统计学意义（ P >0.05）。见图3～4。

各组蛋白水平灰度条带如图5。

2.3 各组炎性细胞因子水平

模型组IL-1β细胞因子水平明显升高，扶正解毒化瘀方组、TZP组以及扶正解毒化瘀方+TZP组均能够有效降低IL-1β水平，TZP组作用优于扶正解毒化瘀方组，差异有统计学意义（ P <0.05）。扶正解毒化瘀方+TZP组优于扶正解毒化瘀方组（ P <0.05），但与TZP组差异无统计学意义（ P =0.407）。模型组IL-18水平明显升高，差异有统计学意义（ P <0.05），扶正解毒化瘀方组、TZP组以及扶正解毒化瘀方+TZP组均能有效降低IL-18水平，差异有统计学意义（ P <0.05），TZP组作用优于扶正解毒化瘀方组（ P =0.033）。扶正解毒化瘀方+TZP组优于扶正解毒化瘀方组，差异有统计学意义（ P <0.05），但与TZP组差异无统计学意义（ P =0.347）。见图6。

3 讨论

对303例老年人肺炎的证候学分析表明，“热毒炽盛、毒瘀互结、正气亏虚”的基本病机贯穿老年风温肺热病始终。扶正解毒化瘀方依据此核心病机确立，经液相色谱-质谱分析，扶正解毒化瘀方全方共鉴别出10个化学成分，分别为槲皮素、芍药苷、木犀草素、野黄芩苷、连翘酯苷H、异荭草苷、连翘苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re，全方入血发挥作用的成分主要为芍药苷、连翘酯苷H、人参皂苷Rb1[10]。芍药总苷可以通过阻断TLR4/5信号通路从而减轻免疫介导的炎性反应[11]，且芍药苷有明显的免疫调节作用[12]。连翘酯苷是连翘的主要活性成分，有学者发现连翘酯苷对铜绿假单胞菌的黏附性和生物被膜有较强的抑制作用[13]，还可降低LPS诱导的肉鸡胸腺内的TNF-α和IL-6的含量[14]。人参皂苷Rb1对脂多糖诱导的大鼠肠系膜微循环障碍有一定保护作用[15]，并且能够缓解TNF-α引起的动脉粥样硬化，而这一过程可能与抑制NF-κB通路有关[16]。可见，扶正解毒化瘀方不仅符合老年风温肺热病的基本病机，从现代药理学角度，其主要成分也具备抗炎、调节免疫等作用。

NLRP3炎性体是NOD2的典型代表。PA感染过程中Caspase-1的激活或者是直接通过细菌的植入，或者是通过间接途径，即通过激活NLRs进而释放炎性反应递质IL-1β和IL-18[17]，诱发机体的免疫炎性反应。炎性体被激活时，NLRP3招募适配器凋亡相关微粒蛋白（ASC）和Caspase-1，之后NLRP3寡聚体化使pro-caspase-1在空间距离上接近，并通过自身切割形成成熟的Caspase-1。Caspase-1活化促使无活性的IL-1β前体转化为成熟而有活性的形式并分泌到细胞外。IL-1β进一步激活IL-1受体复合体，促进IL-8、TNF-α和IL-17等多种细炎性反应递质活化，引起炎性级联反应。另外，NLRP3炎性体还可调控IL-1β的下游加工。NLRP3的mRNA表达增加可导致IL-1β前体的过度合成与释放，从而诱导大量炎性反应递质产生[18-19]。PA感染时，Caspase-1的激活和IL-1β的分泌随着时间和感染量的增加而增多[20]。

NLRP3炎性体已被证明与哮喘、COPD、肺炎支原体肺炎、急性肺损伤等都有密切关系，而中药对以上过程均有一定的调控作用。黄芩的主要成份黄芩苷能够抑制NLRP3的表达，减少炎性反应因子TNF-α，IL-18和IL-1β的分泌从而发挥抗炎作用[21]。知母皂苷是知母的主要成分，其能够下调NLRP3上游NF-κ BiNOS-NO信号通路从而降低相关炎性因子的过度表达[22]。另外，中药薯蓣皂苷可有效抑制NLRP3炎性体的表达，其机制是通过抑制NF-κB信号通路及ROS的释放而实现[23]。在本研究中，扶正解毒化瘀方能降低NLRP3蛋白水平，与TZP联用时作用更为明显;同时能降低IL-1β的mRNA表达，还能明显降低ASC蛋白水平。另外，扶正解毒化瘀方联合TZP能够明显降低炎性因子IL-1β和IL-18的水平。该结果表明扶正解毒化瘀方能够通过调节NLRP3炎性体的作用从而降低LPS诱导的免疫炎性反应，与西药联用或许有增效作用。据此，通过中药干预NLRP3炎性体从而延缓机体的免疫炎性損伤具有一定的指导意义。

參考文献

[1] 高素颖，颜应琳，刘东亮，等.老年人体质指数与代谢指标及心脑血管疾病的关系[J].中国老年学杂志，2017，37（5）：1108-1111.

[2]Borgatta B，Gattarello S，Mazo CA，et al.The clinical significance of pneumonia in patients with respiratory specimens harbouring multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa：a 5-year retrospective study following 5667 patients in four general ICUs[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2017，36（11）：2155-2163.

[3]Imbert PR，Louche A，Luizet JB，et al.A Pseudomonas aeruginosa TIR effector mediates immune evasion by targeting UBAP1 and TLR adaptors[J].EMBO J，2017，36（13）：1869-1887.

[4]Fonceca AM，Zosky GR，Bozanich EM，et al.Accumulation mode particles and LPS exposure induce TLR-4 dependent and independent inflammatory responses in the lung[J].Respir Res，2018，19（1）：15.

[5]Girardin SE，Travassos LH，Hervé M，et al.Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2[J].J Biol Chem，2003，278（43）：41702-41708.

[6]Lin YC，Huang DY，Wang JS，et al.Syk is involved in NLRP3 inflammasome-mediated caspase-1 activation through adaptor ASC phosphorylation and enhanced oligomerization[J].J Leukoc Biol，2015，97（5）：825-835.

[7]李猛，王成祥，徐红日，等.正气亏虚、毒瘀互结是老年性肺炎的基本病机[J].中医药临床杂志，2011，23（4）：353-354.

[8]王成祥，殷人易，徐红日，等.扶正解毒化瘀颗粒对不同危险分层老年肺炎的疗效研究[J].北京中医药大学学报，2013，36（3）：188-191.

[9]Hongri X，Meng L，Chengxiang W，et al.Evaluation on clinical efficacy of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction combined with antibiotics in the treatment of pneumonia in the elderly-A multi-center，double-blind，parallel，randomized controlled trial[J].Complement Ther Med，2018，37：127-132.

[10] 程淼，王明哲，宋金华，等.扶正解毒化瘀方总苷提取物对呼吸道合胞病毒感染宿主细胞炎性反应的影响[J].中国中医药信息杂志，2018，25（12）：35-39.

[11]Zhou Z，Lin J，Huo R，et al.Total glucosides of paeony attenuated functional maturation of dendritic cells via blocking TLR4/5 signaling in vivo[J].Int Immunopharmacol，2012，14（3）：275-282.

[12]王辰允，洪倩，马增春，等.芍药苷对辐射内皮细胞起保护作用的机制[J].解放军药学学报，2010，26（3）：198-202.

[13]张海燕.连翘化学成分及药理活性的研究进展[J].中药材，2000，23（10）：657-660.

[14]吴悦，连翘酯苷对鸡胸腺组织中炎症因子及抗氧化的作用[D].哈尔滨：东北农业大学，2013.

[15]Sun K，Wang CS，Guo J，et al.Protective effects of ginsenoside Rb1，ginsenoside Rg1，and notoginsenoside R1 on lipopolysaccharide-induced microcirculatory disturbance in rat mesentery[J].Life Sci，2007，81（6）：509-518.

[16]Zhou P，Lu S，Luo Y，et al.Attenuation of TNF-α-Induced Inflammatory Injury in Endothelial Cells by Ginsenoside Rb1 via Inhibiting NF-κB，JNK and p38 Signaling Pathways[J].Front Pharmacol，2017，8：464.

[17] Deng Q，Wang Y，Zhang Y，et al.Pseudomonas aeruginosa Triggers Macrophage Autophagy To Escape Intracellular Killing by Activation of the NLRP3 Inflammasome[J].Infect Immun，2016，84（1）：56-66.

[18]Davis BK，Wen H，Ting JP.The inflammasome NLRs in immunity，inflammation，and associated diseases[J].Annu Rev Immunol，2011，29（1）：707-735.

[19]Allen IC，Scull MA，Moore CB，et al.The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA[J].Immunity，2009，30（4）：556-565.

[20]Girardin SE，Boneca IG，Carneiro LA，et al.Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan[J].Science，2003，300（5625）：1584-1587.

[21]文学平，刘德俊，裴忆雪，等.黄芩苷对尿酸钠诱导RAW264.7细胞NLRP3及炎症因子表达的影響[J].中国新药杂志，2018，27（2）：190-194.

[22]钟艳梅，陈坚平，陈淑玲，等.知母皂苷通过调节NF-κB-iNOS-NO信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞功能[J].中国药理学通报，2019，35（2）：198-202.

[23]王丽娜，毕韡玮，牛卫东，等.中药薯蓣皂苷对NLRP3炎性体的作用[J].中国微生态学杂志，2019，31（6）：661-665.

（2019-07-26收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81573924）作者简介：崔兰凤（1989.02—），女，博士研究生，研究方向：中医药防治呼吸系统感染性疾病，E-mail：xiaocui165@126.com通信作者：王成祥（1963.06—），男，博士，主任医师，研究方向：中医药防治呼吸系统感染性疾病，E-mail：wang601@vip.sina.com