绿薄荷茎、叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫3 种保护酶的影响

2020-07-09宋程飞吴兰军段雨闫喜中郝赤

山西农业大学学报（自然科学版） 2020年4期

宋程飞，吴兰军，段雨，闫喜中，郝赤

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

小菜蛾（Plutella xylostellaL.）属鳞翅目，菜蛾科，具有繁殖力高、生命周期短、世代重叠严重和适应性强等特点，已成为全世界十字花科蔬菜最具破坏力的害虫［1，2］。我国长期以来对小菜蛾的防治主要依赖化学手段，过度依赖单一的预防和控制方法引发了许多问题［3，4］。例如，小菜蛾的抗药性逐年增加，化学农药的使用对环境和人类健康也构成了潜在威胁［5，6］。同时，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们的健康和环保意识也在逐步提高［7］。因此，必须探索有效的害虫管理方法以控制小菜蛾种群。与传统的化学合成农药相比，植物源农药具有不同的作用方式，且安全性高、不污染环境和对农产品无残留，越来越被人们接受，已经成为当前农业害虫防治的发展新方向［8］。

绿薄荷（Mentha spicataL.），又名留兰香，多年生芳香草本植物，我国各地均有分布。薄荷具有医用和食用双重功能，还具有较强的杀虫和抗菌作用［9，10］。植物与昆虫行为之间的化学生态学已成为当下研究热点［11，12］，多种植物提取物对害虫有引诱、驱避、毒杀、拒食和生长抑制等作用［13～16］，薄荷也逐渐应用于病虫害防治［17］。薄荷精油对蓝莓果蝇有很强的毒杀效果；对粘虫（Mythimna separate）（Walker）的 3 龄幼虫有明显的拒食作用［18，19］。Raja 等研究表明，薄荷精油对四纹豆象（Callosobruchus maculatus）的产卵有驱避作用，还能影响卵的发育［20］。魏辉等［21］的研究显示出薄荷提取物能抑制小菜蛾幼虫的结蛹，对蛹重也有影响。薄荷还能抑制朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）（Boisduval）体内酶的活性，最终致其死亡［22］。根据相关报道绿薄荷的茎、叶提取物对小菜蛾幼虫的拒食和成虫的产卵忌避均有显著作用［23］。但是，目前关于绿薄荷提取物对小菜蛾幼虫的作用机制尚不明确。

已知许多植物精油和植物提取物可通过影响昆虫正常的呼吸和神经系统功能，使核酸和几丁质的合成受阻，还可以诱导或抑制其体内保护酶活力的变化来阻止外界毒物侵害的影响，以增强其耐药性和抗逆性。大量研究通常以虫体内酶活力的变化情况作为研究植物次生物质对昆虫危害作用机理的参考［24］。昆虫体内的保护酶系主要包括 SOD、POD 和 CAT 等。SOD 具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，机体内SOD 水平的高低可作为衰老与死亡的直观指标。SOD 可将体内超氧阴离子自由基清除，以形成过氧化氢（H2O2），尽管H2O2仍是对机体有害的活性氧，但体内的CAT 和POD 会立即将其分解为完全无害的水。生物细胞内的自由基通常是在这3 种保护酶作用下产生和清除的，它们组成了一个完整的防氧化链条。在正常状态下，维持较低水平的动态平衡，可以防止自由基的毒害作用。因此，保护酶系一旦破坏，体内自由基水平失衡，直接影响细胞功能，严重时可致死［25，26］。有报道证实，昆虫暴露在不利环境中时保护酶活性降低［27］。而在腐胺和亚精胺作用下，小菜蛾体内SOD 和POD 的活力增强［28］。朱香镇等［29］研究了 2 种植物源次生物质对绿盲蝽（Apolygus lucorum）不同龄期幼虫的CAT、SOD 和POD 的活性影响，发现绿盲蝽受到不同种类外源次生物质或者不同浓度同种外源次生物质胁迫后，体内保护酶活性的变化是一个复杂的过程。

因此，本试验通过浸叶法，使小菜蛾3 龄幼虫取食被不同浓度绿薄荷茎、叶乙醇提取物浸泡处理后的甘蓝叶盘，分别在 12、24、36 和 48 h 后测定其体内主要保护酶的活力，从而判断绿薄荷茎、叶提取物对小菜蛾幼虫的作用机理，为研究以绿薄荷提取物为主要物质的植物源农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

绿薄荷（Mentha spicataL.）于 2018 年 5 月种植于山西农业大学农作站（北纬 37°25′22′′，东经112°34′15′′），分别采集鲜嫩程度一致、株高 25～30 cm、干净无虫害植株的茎、叶部分以制备乙醇提取物。

甘蓝（Brassica oleraceaL.）于 2018 年 5 月种植于山西农业大学，品种五月慢，在温室条件下定期施肥和浇水，供试验所用。

1.2 供试虫源

小菜蛾是从山西农业大学农作站菜地中收集的幼虫和蛹。经山西农业大学昆虫神经行为与感觉生物学实验室在温度（25±1.0）℃，相对湿度70%±5%，光周期14L∶10D 的条件下饲养供试验所用。

1.3 主要试剂

Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、无水碳酸钠和无水乙醇均购于天津市天力化学试剂有限公司；愈创木酚、浓硫酸、高锰酸钾和甲硫氨酸（Met）均购于北京化工厂；乙二胺四乙酸（EDTA-Na2）和30% H2O2购于天津市风船化学试剂科技有限公司；核黄素购于北京京泽旺化工试剂有限公司；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）购于上海蓝季科技发展有限公司；牛血清蛋白（BSA）购于上海励瑞生物科技有限公司。

1.4 酶液的制备

参照陈立等的浸叶法，稍作改进［30］。将甘蓝叶片分别用浓度为 12.5、25、50 和 100 mg·mL-1的绿薄荷茎、叶乙醇提取物浸泡30 s，在室温下将溶剂蒸发数小时，喂食小菜蛾 3 龄幼虫，12、24、36、48 h 后随机选取10 头活跃的幼虫制备酶液，置于0.5 mL 浓度为 0.5 mol·L-1的磷酸缓冲液（pH=7）中匀浆，15 000 r·min-1离心 15 min。上清液用作酶原，重复6 次［31］。以95%乙醇处理的甘蓝叶片喂食幼虫，作为对照。根据考马斯亮蓝G-250 法测定每个样品中的蛋白质浓度，以计算比活［32］。

1.5 小菜蛾幼虫体内SOD 活性测定

参照李周直等的方法，经改进后测定SOD 活力［25］。在试管中加入 5 mL 反应液和 100 μL 酶液，混匀，不加酶液的试管作为最大光反应还原管。在25 ℃、4000 lx 的培养箱内进行反应，相同条件下，避光处理的反应管作为对照。20 min 后遮光以终止反应，并在560 nm 处测定OD 值，以达到50%抑制率所需的酶量为1 个酶活力单位。

1.6 小菜蛾幼虫体内POD 活性测定

POD 活力测定参考Simon 等的愈创木酚比色法，稍作改进［33］。在试管中分别加入 250 μL 愈创木酚反应液和 50 μL 酶液；反应液中加入 50 μL 蒸馏水，作为对照。在H2O2环境下反应3 min，并在470 nm 处测定OD 值，以每分钟OD470的变化量为POD 的1 个酶活力单位。

1.7 小菜蛾幼虫体内CAT 活性测定

通过参考Chance &Machly 的方法，改进后测定 CAT 活力［34］。在活性测定中，对照组加 H2O2溶液 0.5 mL 和 0.5 mol·L-1的 PBS 0.5 mL；试验组加 H2O2溶液 0.5 mL 和 0.5 mL 酶液，于 30℃中水浴 10 min 后，加入 0.5 mL 的 10% 的硫酸，以终止反应。用 0.1 mmol·L-1KMnO4标液滴定剩余的H2O2，记录滴定所用的KMnO4体积。用每mg 蛋白在 10 min 内分解 H2O2的 mg 数表示 CAT 的一个酶活力单位。

1.8 数据分析

使用SPSS 21.0 对试验数据进行统计分析，数据以平均值±标准误差表示。采用one-way ANOVA 比较绿薄荷茎和叶提取物处理后不同时间内3 种保护酶在0.05 水平上的差异性。

2 结果与分析

2.1 绿薄荷茎、叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫生长状态的影响

不同浓度的绿薄荷茎、叶提取物处理甘蓝叶片后，饲喂小菜蛾3 龄幼虫，试验初期幼虫均不同程度地表现出典型的兴奋症状，在培养皿内快速爬行后，动作渐趋缓慢，最后静止不动。有的处理组试虫短暂麻痹，用小毛刷触之反应迟钝，但部分麻痹的幼虫有苏醒的现象。定期观察时发现，幼虫取食量有不同程度的下降，少量虫体停止取食。同时，个别幼虫有体色变黑、失水变软、身体萎缩的中毒症状。试验组的幼虫生长发育缓慢，虫体明显小于正常生长的对照组虫体，部分试虫提前化蛹。

2.2 绿薄荷茎、叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫体内SOD 的影响

通过浸叶法，使用不同浓度的绿薄荷茎、叶提取物处理甘蓝叶片后饲喂小菜蛾幼虫，其体内SOD 活力如图1 所示，随着作用时间增加，小菜蛾体内SOD 活力均表现为先升高后下降，而空白对照的SOD 活性基本处于动态平衡。在12.5 和25 mg·mL-1浓度下，酶活力在 12～36 h 均呈上升趋势，36 h 时达到最高，随后下降，至48 h 时，试验组的酶活力与对照处于同一水平，无抑制作用；在50和 100 mg·mL-1浓度下，酶活力在 12～24 h 呈上升趋势，24 h 时达到最高，随后下降且低于对照，至48 h 时，试验组的酶活力较低，其中，浓度为100 mg·mL-1的茎和叶提取物作用下SOD 活力最低，分别为 1.43 和1.42 U·mg-1pro，有明显的抑制作用。这表明小菜蛾幼虫取食处理的叶片后，开始受绿薄荷提取物影响，虫体内产生毒力作用，幼虫SOD 被激活从而保护虫体不被伤害；随着时间的增加，其体内产生的毒力作用增加，SOD 活力低于对照，表明虫体内产生的超氧阴离子自由基不能被及时清除，自身防御能力下降。

从整体变化趋势看，乙醇提取物的浓度越大，SOD 活力越低，随着时间的增加，茎、叶提取物对小菜蛾幼虫体内SOD 活力的影响效果基本一致。大部分经茎提取物处理后虫体的酶活力较大，仅在 100 mg·mL-1浓度下处理的 36 h 和 48 h 茎叶之间无显著性差异。

2.3 绿薄荷茎、叶提取物对小菜蛾幼虫生长发育及体内POD 的影响

不同浓度的绿薄荷茎、叶提取物饲喂小菜蛾幼虫后，其体内POD 活力如图2 所示，随着作用时间增加，小菜蛾体内POD 活力均表现为先升高后下降，而空白对照的POD 活性基本处于动态平衡。各处理浓度下，12 h 时，对照组的酶活力均高于处理组，表明处理初期POD 未被激活。在12～36 h处理组的酶活力出现上升并显著高于对照组，36 h达到最高，表明小菜蛾体内POD 被激活，以维持其正常的生理功能。36～48 h 呈现下降趋势，仅12.5 mg·mL-1在 48 h 时酶活力仍略高于对照组，表明低浓度的绿薄荷经提取物对小菜蛾的POD 无抑制作用；而高浓度下的酶活力显著低于对照组，绿薄荷茎、叶提取物对虫体内POD 产生抑制作用，其中，浓度为100 mg·mL-1的茎和叶提取物作用下POD 活力最低，分别为 1.12 和 1.29 U·mg-1·min pro，表明随着时间的增加可能由于体内有毒物质增加，抑制小菜蛾体内POD 的活性，从而使小菜蛾失去保护机制。

在 12.5 和 25 mg·mL-1浓度作用下，仅在 12 h时，绿薄荷茎提取物对小菜蛾幼虫体内的POD 活力低于叶，其他时间均表现出经过叶提取物处理后的酶活力较大（图 2-A、2-B）；在 50 mg·mL-1作用下，24 h 和36 h 时，茎提取物处理后的酶活力显著高于叶（图2-C）；在100 mg·mL-1作用下，24时，茎提取物处理后的酶活力显著高于叶（图2-D）。

图1 绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾幼虫体内SOD 作用的比较Fig.1 Effects of extracts at different concentrations on the SOD activity of P.xylostella larvae

2.4 绿薄荷茎、叶提取物对小菜蛾幼虫体内CAT的影响

不同浓度的绿薄荷茎、叶提取物饲喂小菜蛾幼虫后，其体内CAT 活力如图2 所示，随着作用时间增加，小菜蛾体内CAT 活力均表现为先升高后下降，而空白对照的CAT 活性基本处于动态平衡。12 h 时，各处理浓度下，对照组的酶活力均高于处理组，其中，浓度为 100 和 25 mg·mL-1的茎和叶提取物作用下CAT 活力最低，分别为 3.5 和3.13 U·mg-1pro，表明处理初期 CAT 暂时被抑制；12～36 h 酶活力逐渐升高，36 h 达到最高，表明在处理开始时对小菜蛾幼虫产生毒害作用，抑制了CAT 活力，随着时间的增加虫体做出反应，小菜蛾幼虫体内CAT 被激活，以保护机体不受侵害。在 48 h，12.5 mg·mL-1酶活力大于对照组，而50 和 100 mg·mL-1的 CAT 活力显著低于对照组，表明绿薄荷提取物浓度越高对小菜蛾CAT 活抑制作用越强，虫体自身清除体浓度越高内氧自由基的能力明显下降，使虫体失去保护机制。同时，随着乙醇提取物的浓度增大CAT 活力降低。

图2 绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾幼虫体内POD 作用的比较Fig.2 Effects of extracts at different concentration on the POD activity of P.xylostella larvae

在 12 h 和 24 h 时，100 mg·mL-1的绿薄荷叶提取物对小菜蛾幼虫体内的CAT 活力高于茎，其他浓度则相反（图 3-A 和 3-B）；36 h 时，12.5 和 25 mg·mL-1表现出茎大于叶，而 50 和 100 mg·mL-1则表现出叶大于茎（图3-C）；48 h 时，浓度为12.5和100 mg·mL-1的绿薄荷茎提取物的幼虫体内的CAT 活力高于叶，25 和 50 mg·mL-1的叶提取物表现出的活力高于茎（图3-D）。

3 讨论

近年来，植物源农药在害虫防治方面的应用备受关注，而植物活性物以其对人畜、环境等无害的特点已成为当下研究热点。绿薄荷作为植物源农药的原材料用于防治害虫，具有很大的发展潜力。吴兰军［24］前期研究发现，绿薄荷茎、叶提取物对小菜蛾具有毒杀、拒食和产卵忌避等作用。

昆虫在正常状态下，体内的酶系统处于动态平衡；受到外界刺激时，体内酶系统失衡，代谢紊乱，甚至出现死亡现象［35］。为了适应环境中的化学农药及有毒物质等的毒害，昆虫在进化过程中，体内逐渐形成了具有代谢分解外来有毒物质的防卫体系。有研究表明光活化杀虫剂α-三噻吩作用于淡色库蚊（Culex pipiens）后，虫体内保护酶（SOD、POD 和CAT）的活性降低，致使其体内的超氧阴离子自由基等活性氧不能在短期内清除，影响到虫体正常的生理代谢功能，严重时死亡［36］。Wei 等［37］发现，使用土荆芥精油处理小菜蛾幼虫后，显著影响内源性保护酶（SOD，POD 和CAT）的活性，其中，SOD 和CAT 活性升高，这可能会提高小菜蛾应对环境压力的能力，从而使化学病虫害防治变得复杂。

图3 绿薄荷茎和叶提取物对小菜蛾幼虫体内CAT 作用的比较Fig.3 Effects of extracts at different concentrations on the CAT activity of P.xylostella larvae

小菜蛾以毒害物质为食后，体内的酶活性会改变，为了解有毒物质在虫体内的作用机制，我们测试了3 种主要保护酶的活性。经研究发现，处理后，随着提取物作用时间增加，小菜蛾体内3 种保护酶活力均表现为先升高后下降。浓度为100 mg·mL-1的茎和叶提取物作用 48 h 时，SOD 活力最低分别为 1.43 和 1.42 U·mg-1pro；POD 活力最低分别为 1.12 和 1.29 U·mg-1·min pro。而 12 h时，浓度为 100 和 25 mg·mL-1的茎和叶提取物作用下 CAT 活力最低，分别为 3.5 和 3.13 U·mg-1·min pro。同时，乙醇提取物的浓度与SOD 和CAT的活力基本呈负相关，且绿薄荷叶的乙醇提取物对小菜蛾体内几种主要保护酶的抑制作用大于茎。这可能是小菜蛾在遇到外界刺激后产生的应激反应，说明小菜蛾幼虫取食绿薄荷提取物后打

破了体内保护酶SOD、POD 和CAT 的动态平衡，酶活力被抑制从而对虫体产生毒害。因此，该提取物对小菜蛾的作用机理也与这几种保护酶有关。银杏（Ginkgo bilobaL.）外种皮提取物对小菜蛾保护酶CAT、POD 活性的影响也有同样的规律［38］。同时香根草（Vetiveria zizanioidesL.）提取物对二化螟（Chilo suppressalis）（Walker）幼虫体内保护酶SOD、POD 和CAT 的影响及桑叶（Morus albaL.）提取物对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）保护酶SOD 和CAT 酶活性影响也呈现先诱导后抑制作用［39，40］。姬兰柱等［41］发现细辛精油对粘虫和亚洲玉米螟体内SOD 有抑制作用。张成文等［42］的研究结果与本研究的结果相反，虫螨腈作用于甜菜夜蛾后，虫体内CAT 活性先抑制后激活。前人对植物提取物相关的研究，多以茎叶混合物直接提取后进行试验，而本研究分别对茎和叶的乙醇提取物的作用效果进行比较，且绿薄荷叶提取物对小菜蛾体内几种保护酶的抑制作用大于茎［43～45］。