李丽丽　郑敏　杨洪一

摘 要： 利用CTAB法分离辣椒叶片总RNA，利用RT-PCR技术扩增出了辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组不同区域片段。并经克隆、测序，证明其为辣椒轻斑驳病毒特异序列。经序列拼接，获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列;该序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组的序列同源性为94.0%～99.6%。系统进化分析显示辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb与日本分离物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）亲缘关系较近，与西班牙分离物Ia亲缘关系较远。

关键词： 辣椒;辣椒轻斑驳病毒;基因组

中图分类号：S641.3    文献标志码：A    文章编号：1673-2871（2020）06-012-05

Abstract： Total RNA was isolated from leaves of pepper using CTAB method. The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus （PMMoV） were amplified by RT-PCR， and the PMMoV-specific fragments were confirmed by cloning and sequencing. A 6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained. The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94.0%-99.6%. Phylogenetic analysis indicated that there was close genetic relationship between isolate Hrb with Japan isolates （PMMoV-J， C-1421， Pa18， and TPO-2-19）. In addition， there was far genetic relationship between isolate Hrb with Spanish isolate Ia.

Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus; Genome

辣椒輕斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是当前辣椒生产中遇到的主要病毒之一[1]。辣椒轻斑驳病毒属烟草花叶病毒属（Tobamovirus），病毒粒体呈直杆状。辣椒轻斑驳病毒曾在英国、美国辣椒田中引起毁灭性灾害，目前该病毒已在美国、德国、日本等地广泛发生，并在世界各地广泛分布[2]。向本春等[3]于1994年在新疆辣椒上发现了辣椒轻斑驳病毒，是我国的首次报道。此后，相继在青岛、北京等地广泛被报道[4]。辣椒轻斑驳病毒为种传病毒，带毒种子是病毒扩散的重要因素。辣椒轻斑驳病毒可随辣椒制品进入人体，经消化、排出体外后仍具有侵染性[5]。早期侵染后，辣椒轻斑驳病毒可使叶片轻度褪绿，部分植株矮化，症状可能较轻微;后期可能使叶片斑驳、黄化，可使辣椒果实呈现凹凸、坏死斑点或浅黄色斑驳，从而影响辣椒产量及品质[1]。

辣椒轻斑驳病毒对辣椒生产造成了巨大威胁，因而迫切需要控制辣椒轻斑驳病毒造成的危害。培育抗病毒品种是控制植物病毒病危害的主要策略，当前已获得了辣椒轻斑驳病毒的抗性基因[6]。然而，由于病毒的快速变异，一些新的病毒分离物可能使抗性基因失效[7-9]。获得病毒不同分离物的基因组序列并分析其分子变异特点是病毒防控的基础性工作。笔者在前期研究中已获得了一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物，在本试验中探索获得其基因组序列并分析其分子变异特点。

1 材料与方法

1.1 材料

感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒植株于2014年取自哈尔滨农田，经RT-PCR鉴定其为辣椒轻斑驳病毒。该分离物被命名为Hrb。

基于辣椒轻斑驳病毒基因组序列（GenBank登陆号：NC_003630）设计引物。引物序列见表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 总RNA分离

向离心管中加入490 μL CTAB、10 μL β-巯基乙醇。采集幼嫩叶片，经液氮速冻，快速研磨至细粉，并转入离心管。轻轻晃动离心管，65 ℃水浴，之后加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀后12 000 r·min-1离心5 min。取上清，再次进行氯仿/异戊醇抽提、12 000 r·min-1离心5 min。取上清并加入1/10体积3 mol·L-1醋酸钠、三倍体积无水乙醇，混匀后12 000 r·min-1离心5 min。加入30 μL去离子水溶解沉淀。

1.3 利用RT-PCR技术扩增病毒基因组不同区域片段

反转录体系如下：总RNA 1.0 μL，RNase free H2O 12 μL，M-MLV Buffer 4 μL，随机引物1.0 μL，dNTPs 0.5 μL（10 mmol·L-1），RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，M-MLV 1 μL（200 U）。反应条件为：37 ℃ 2.5 h，72 ℃ 30 min。

PCR体系如下：反转录产物2 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl2 3 μL，10%甘油2 μL，上下游引物各2 μL（引物组合分别为A11/A22，B11/B22，C11/C22，D11/D22，E11/E22，F11/F22），dNTPs 0.4 μL（10 mmol·L-1），Taq DNA酶0.75 U，加去离子水至25 μL。反应条件：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 5 min。

1.4 PCR产物的克隆和测序

利用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，将回收的目的片段与pMD-18T载体连接。反应体系如下：5 μL solution I buffer，1 μL pMD-18T载体，1 μL回收目的片段及3 μL去离子水，4 ℃过夜连接。

将10 μL连接产物加入30 μL JM109感受态细胞中，冰上放置30 min;42 ℃热激45 s;冰浴1 min，加入LB液体培养基进行培养。经蓝白斑筛选、PCR技术筛选阳性克隆，之后对阳性克隆进行双向测序。

使用DNAMAN软件对测序结果进行序列拼接;之后利用BLAST进行序列比较。利用CLUSTAL 1.83进行多序列比对。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增及测序

利用CTAB法分离辣椒叶片总RNA，利用扩增辣椒轻斑驳病毒基因组不同区域的引物对，经过不断优化RT-PCR反应条件，最终扩增出了预期的辣椒轻斑驳病毒基因组不同区域片段（图1）。利用胶回收试剂盒，将扩增产物进行切胶回收纯化。之后进行克隆、测序，获得了辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组不同区域片段的序列。

2.2 基因组特点分析

經序列拼接，获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列（图2）;该序列腺嘌呤∶胸腺嘧啶∶鸟嘌呤∶胞嘧啶的比例为19∶18∶15∶12。其核苷酸序列比GenBank中已报道的辣椒轻斑驳病毒基因组序列（GenBank登陆号：NC_003630）在700～768 nt处缺少69个核苷酸;序列缺失其并未造成移码突变;在GenBank中未见类似缺失核苷酸的辣椒轻斑驳病毒分离物。

获得的基因组序列包含4个开放阅读框（ORF）：ORF1（70～4 842 nt）、ORF2（70～3 357 nt）、ORF3（4 843～5 616 nt）、ORF4（5 619～6 092 nt）分别编码183 KDa蛋白、126 KDa蛋白、运动蛋白（28 KDa）、外壳蛋白（17 KDa）。3非编码区、5非编码区分别为198 nt、69 nt（图2）。

辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组序列同源性为94.0%～99.6%，中国分离物Hrb的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4所编码蛋白分别与其他分离物氨基酸序列同源性为96.2%～97.7%、95.4%～96.8%、96.5%～99.6%、94.3%～98.1%（表2）。中国分离物Hrb非编码区序列与其他分离物同源性分别为95.7%～98.6%、97.5%～100%。

将得到的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组序列与烟草花叶病毒属内其他病毒进行了序列比较。此分离物与番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）亲缘关系最近，核苷酸序列相似性为68.5%;与郁金香脉明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）亲缘关系最远。ORF1、ORF2、ORF4的核苷酸序列相似性、氨基酸序列相似性均与番茄花叶病毒相似性最高，其次为烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）;与郁金香脉明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）相似性最低。

基于辣椒轻斑驳病毒基因组运动蛋白及外壳蛋白序列，对不同辣椒轻斑驳病毒分离物进行了系统进化分析。获得的分离物与日本分离物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）亲缘关系较近，并聚集在一起形成一个小的进化枝（图3）;与西班牙分离物Ia亲缘关系较远。

3 讨论与结论

我国自1994年首次报道了辣椒轻斑驳病毒后已有较多关于辣椒轻斑驳病毒危害辣椒的报道[1，3-4，9]。然而，当前尚未引起辣椒生产及科研人员的广泛重视。辣椒种子可携带辣椒轻斑驳病毒，因而利于其快速传播。此外，人类粪便中的辣椒轻斑驳病毒也具有侵染性，即使常规堆肥也难以彻底杀灭植物残体、粪便中的辣椒轻斑驳病毒[5]。因而，当前我国辣椒轻斑驳病毒的危害范围可能远远超过现有报道中的分布范围。

目前已有的辣椒轻斑驳病毒的报道主要集中于华北、华东等地[1，4，9]，其他地域的相关报道较少，且该病毒中国分离物的分子变异特点也尚不明晰。东北林业大学生命科学学院植物病原微生物课题组前期研究中已获得了一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物，笔者获得了其基因组序列并分析了其分子变异特点。当前我国已报道的辣椒轻斑驳病毒分离物较少，有必要通过大规模筛选分离，获得更多辣椒轻斑驳病毒中国分离物，并进一步分析当前主要抗辣椒轻斑驳病毒基因对不同病毒分离物的有效性。

经RT-PCR、克隆、测序，获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列;该序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组的序列同源性为94.0%～99.6%。系统进化分析显示辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb与日本分离物亲缘关系较近，与西班牙分离物Ia亲缘关系较远。

参考文献

[1]      王亚南，赵绪生，袁文龙，等.辣椒轻斑驳病毒研究现状[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7401-7402.

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[3]      向本春，谢浩，崔星明，等.新疆辣椒轻微斑驳病毒的分离鉴定[J].病毒学报，1994，10（3）：240-245.

[4]      陈青，余芳平，林石明，等.进境辣椒种子中检测出辣椒轻斑驳病毒[J].植物检疫，2005，19（5）：295-296.

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[7]      HIROYUKI H，REIKO T，YASUYA I，et al.Cooperative effect of two amino acid mutations in the coat protein of Pepper mild mottle virus overcomes L3-mediated resistance in Capsicum plants[J].Virus Genes，2007，34（2）：205-214.

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[9]      鄭敏.辣椒轻斑驳病毒的鉴定及基因组分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2013.