刘飞 严奇 胡俊 赵友谊 王鸣 李冬玲 佟海英 王奇志

摘要：采用浸渍法、渗漉法、回流法、超声法、索氏法提取方法对杨树皮总类脂的提取工艺进行研究，通过比较不同提取方法的总类脂得率、操作难度，选择渗漉法作为杨树皮总类脂的最佳提取方法。以杨树皮总类脂得率为指标，设计4因素3水平的L9（34）正交试验，考察浸渍时间、粉碎程度、液料比、流速对渗漉法提取得率的影响，优化渗漉提取工艺。渗漉法的最佳提取条件如下：杨树皮粗粉过筛孔径为（335±13） μm，浸渍时间为3 d，液料比为12 mL ∶ 1 g，流速为3 mL/min。研究得出的提取工艺简单有效，是杨树皮总类脂的最佳提取工艺。

关键词：加拿大杨;杨树皮类脂;提取工艺;正交试验法

中图分类号： S132  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0236-04

收稿日期：2019-05-07

基金项目：江苏省科技计划社会发展-面上项目（编号：BE2016753）。

作者简介：刘 飞（1985—），男，山东临沂人，博士，助理研究员，主要从事有机合成研究。E-mail：liufeiseu@163.com。

通信作者：王奇志，博士，研究员，主要从事天然产物化学研究。 E-mail：wangqizhi@cnbg.com。

杨树系杨柳科杨属植物的统称，全球约有100余种，生长于亚洲、欧洲及北美洲。我国杨树资源丰富、种类繁多，约有62种，广泛分布于全国各地[1]。加杨，亦称加拿大杨，为大乔木，是美洲黑杨与欧洲黑杨的杂交种，除西藏自治区、云南省、广东省等地区外，其他省份均有种植。加杨树干通直挺拔，树皮粗厚，因其生长速度快、适应性强、繁殖能力强，是造林、绿化的优良树种之一;其材质轻软，纹理直，易干燥加工，也被应用于建筑材料行业，具有一定的经济价值[1]。

杨树皮类脂是一种从杨树皮中提取得到的橙黄色脂溶性物质，能够止痒消肿、促进溃疡愈合、减少皮肤损伤;能够抑制大肠杆菌，治疗家畜腹泻;外用于禽畜，能够杀螨止痒[2]。杨树皮类脂不仅含有动物体内不可缺少的、构成生物膜的重要结构成分，如磷脂、糖脂、固醇等，还含有多种常量和微量元素、维生素E、18种氨基酸及不饱和脂肪酸、甾醇等天然生物学活性成分[3]。不饱和甾醇是合成维生素D和各种激素的原料组分，具有降血脂、预防心血管疾病等功效[4-5]，能够诱导口腔鳞状细胞癌、宫颈癌等癌细胞凋亡[6-7]。维生素E可作为催化剂参与物质代谢，能够保护生殖系统，提高动物的受精率和产蛋率[2，8]。脂肪酸可用于生产肥皂、洗发乳等日化产品，特别是其中的亚油酸，不仅是机体代谢的必需脂肪酸[9]，其钙盐还可作为功能性饲料添加剂;锌盐可用于治疗皮肤性疾病;镁盐可用于生产各类药品、保健品;钠盐、钾盐可作为食品防腐剂，同时兼备营养保健功能[10]。由于杨树皮类脂独有的天然生物学活性，并在畜牧、医药等领域具有一定的经济价值和应用前景，因此，开发高效、环保、精准、简洁的从木材加工副产物杨树皮中提取的类脂类成分具有重要意义，可为杨树皮资源的进一步开发利用提供相关科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 木材加工副产物杨树皮由江苏泗阳昇茂木业有限公司提供，经江苏省中国科学院植物研究所袁昌齐研究员鉴定为加拿大杨，粉碎成粗粉，备用。标本现存于江苏省中国科学院植物研究所药用植物研究开发中心（标本编号：Pc20170919）;所用试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 R-210型旋转蒸发器，瑞士Buchi公司生产;LIBROR AEL-200型电子天平，南京科尔仪器设备有限公司;DK-98-Ⅱ 型电热恒温水浴锅，南京科尔仪器设备有限公司;超声仪，南京科尔仪器设备有限公司生产;索氏提取器，南京科尔仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

为了选择提取杨树皮总类脂的最佳提取方法，以石油醚为溶剂，采用浸渍法、渗漉法、回流法、超声法及索氏法进行中试规模的提取工艺研究，通过比较总类脂得率，选出杨树皮总类脂的最佳提取方法。

1.2.1 浸渍法 称取1 kg杨树皮粗粉置于锥形瓶中，加入5倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），室温浸渍7 d后，抽滤，收集滤液;重复上述过程，用薄层层析法检测植物甾醇和维生素E是否提取完全。停止浸渍，共提取4次，合并滤液;压榨粗粉，将压榨液与滤液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算总类脂得率。总液料比为20 mL ∶ 1 g，总类脂得率为5.39%。

1.2.2 渗漉法 称取1 kg杨树皮粗粉置于烧杯中，加入3倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），均匀搅拌后，密闭放置3 h。而后，将混合液均匀装入渗漉筒，缓慢加入石油醚以排除气泡（始终保持溶剂浸没药材表面）。室温浸渍3 d后，开始渗漉，流速为 3 mL/min。先收集粗粉量85%的初漉液，续漉液减压浓缩后与初漉液合并;用薄层层析法检测植物甾醇与维生素E是否提取完全。停止渗漉，压榨粗粉，将压榨液与渗漉液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算总类脂得率。总液料比为12 mL ∶ 1 g，总类脂得率为8.19%。

1.2.3 回流法 称取1 kg杨树皮粗粉置于回流装置中，加入约3.5倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），80 ℃加热回流2 h，抽滤，收集提取液;重复上述过程，用薄层层析法检测植物甾醇和维生素E是否提取完全。停止回流，共提取3次，每次2 h，合并抽濾液;压榨粗粉，将压榨液与滤液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算总类脂得率。总液料比约为10 mL ∶ 1 g，总类脂得率为7.91%。

1.2.4 超声法 称取1 kg杨树皮粗粉置于锥形瓶中，加入约3.5倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），室温浸泡过夜。设定超声频率为175 W，室温提取30 min，抽滤，收集提取液;重复上述过程，用薄层层析法检测植物甾醇和维生素E是否提取完全。停止超声，共提取3次，合并抽滤液;压榨粗粉，将压榨液与滤液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算总类脂得率。总液料比约为10 mL ∶ 1 g，总类脂得率为6.86%。

1.2.5 索氏法 称取1 kg杨树皮粗粉置于索氏提取装置中，加入6倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），80 ℃加热提取5 h，共虹吸7次;压榨粗粉，将压榨液与滤液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算总类脂得率。总液料比为6 mL ∶ 1 g，总类脂得率为8.31%。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法的比较

表1结果表明，浸渍法液料比为20 mL ∶ 1 g时，总类脂得率为5.39%;渗漉法液料比为 12 mL ∶ 1 g，总类脂得率为819%;回流法液料比为10 mL ∶ 1 g，总类脂得率为791%;超声法液料比为10 mL ∶ 1 g，总类脂得率为686%;索氏法液料比为6 mL ∶ 1 g，总类脂得率为8.31%。

从表1还可以看出，不同提取方法的杨树皮总类脂得率排序为索氏法>渗漉法>回流法>超声法>浸渍法，即索氏法对杨树皮总类脂的提取率最高，渗漉法次之，而浸渍法的提取率最低。虽然索氏法提取率最高且溶剂用量最少，但需加热，消耗能源;同时，工业生产中缺乏大型的索氏提取器，无法承担大规模的低极性物质提取;此外，与渗漉法相比，对杨树皮总类脂的提取率相差不大。因此，综合考虑提取溶剂的用量、水电成本、操作简单安全等因素，渗漉法较适合杨树皮总类脂的提取。

2.2 正交试验设计

在前期单因素试验的基础上，综合考虑各方面因素，确定以渗漉法作为杨树皮总类脂的最佳提取方法。以杨树皮总类脂得率为指标，以杨树皮粉碎程度（过筛孔径）、浸渍时间、液料比、流速为考察因素，设计了4因素3水平的L9（34）正交试验，研究渗漉法的最佳提取条件，正交试验因素与水平设置见表2。

2.3 正交样品的制备

将杨树皮粉碎成中等粉（按表2设定的孔径，过筛），称取1 kg杨树皮粗粉置于烧杯中，加入3倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），均匀搅拌后，密闭放置3 h。而后均匀装入渗漉筒，缓慢加入石油醚以排除气泡（始终保持溶剂浸没药材表面）。在室温下，按表2设定的时间浸渍后，按表2设定的液料比和流速开始渗漉。先收集粗粉量85%的初漉液，减压浓缩续漉液后，将其与初漉液合并;用薄层层析法检测植物甾醇和维生素E是否提取完全，停止渗漉，压榨杨树皮粉，将压榨液与渗漉液合并，减压浓缩得到杨树皮总类脂，计算得率。

2.4 正交试验结果与分析

按L9 （34）正交试验表（表2）进行正交试验研究，试验结果见表3。

从表4可以看出，以杨树皮总类脂得率为考察指标，影响因素依次为A、B、D、C，即粉碎程度的影响最大，其依次为浸渍时间、流速、液料比。根据方差分析结果，A因素对渗漉法的影响有显著性差异，B、D因素并无显著性差异。根据表2各因素k值的变化，A2 >A3 >A1，B3 >B2 >B1，C1>C2>C3，D3 >D2 >D1，得出A因素应选择水平2，B和D因素应选择水平3，C因素应选择水平1，即A2B3C1D3。最终确定采用渗漉法提取杨树皮总类脂的最佳提取条件为A2B3C1D3，即将杨树皮粉碎成中等粉，过筛孔径为（335±13）μm，加入3倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），均匀搅拌后，密闭放置3 h。而后均匀装入渗漉筒，缓慢加入石油醚以排除气泡（始终保持溶剂浸没药材表面）。室温浸渍 3 d 后，以液料比12 mL ∶ 1 g、流速3 mL/min开始渗漉，先收集粗粉量85%的初漉液，减压浓缩续漉液后，将其与初漉液合并;洗脱液耗尽后，停止渗漉，压榨粗粉，将压榨液与渗漉液合并，减压浓缩即得杨树皮总类脂。

2.5 最佳渗漉提取条件的验证

按照上述最佳渗漉提取工艺进行3次验证试验，试验结果见表5。由验证结果可知，按最佳渗漉提取工艺得到的杨树皮总类脂得率均高于其他各正交试验值，3份样品杨树皮总类脂的平均得率为8.81%，相对标准偏差（RSD）为0.177%，说明该提取工艺得率高、稳定，达到了优化杨树皮总类脂提取工艺的目的。

3 结论

杨树皮总类脂的主要活性成分为植物甾醇、维生素E等，本试验选用植物甾醇和维生素E 2种成分作为主要鉴别物质，采用薄层层析法检测杨树皮总类脂是否提取完全，操作简单，干扰少，测定结果更为准确。

本研究以石油醚为溶剂，采用浸渍法、渗漉法、回流法、超声法、索氏法提取杨树皮总类脂，比较其得率，选择杨树皮总类脂的最佳提取方法为渗漉提取法。

本研究对杨树皮粉碎程度（过筛孔径）、浸渍时间、液料比、流速等条件进行优化，设计了4因素3水平的L9（34）正交试验，确定了杨树皮总类脂的最佳提取条件：将杨树皮粉碎成中等粉，过筛孔径为（335±13）μm，加入3倍生药体积的石油醚（60～90 ℃），搅拌均匀后，密闭放置3 h。而后均匀装入渗漉筒，缓慢加入石油醚以排除气泡（始终保持溶剂浸没药材表面）。室温浸渍3 d后，以液料比 12 mL ∶ 1 g、流速3 mL/min开始渗漉，先收集粗粉量85%的初漉液，减压浓缩续漉液后，将其与初漉液合并;洗脱液耗尽后，停止渗漉，压榨粗粉，将压榨液与渗漉液合并，减压浓缩即得杨树皮总类脂。该提取工艺安全稳定、操作简单、提取率高，适用于杨树皮总类脂的工业化提取。

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