高义霞 呼丽萍 袁毅君

摘要：为了充分利用农业废弃物苹果疏果，以花牛苹果疏果为材料，通过微波辅助提取苹果多酚，利用大孔树脂NKA-9对提取的粗多酚进行分离，再通过Sephadex LH-20进一步纯化分离精制，得到5种单体酚，分别为绿原酸、表儿茶素、根皮苷类、儿茶素、槲皮素;利用分光光度法测定各单体酚对血管紧张素酶的抑制效果。结果表明，槲皮素、根皮苷、儿茶素、表儿茶素具有明显的抑制ACE的作用，与阳性药物相比较，槲皮素和根皮苷的效果明显优于卡托普利，表儿茶素和儿茶素的效果与卡托普利相当。

关键词：苹果多酚;降血压;ACE酶抑制;绿原酸;表儿茶素;根皮苷;儿茶素;槲皮素

中图分类号： R284  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0232-04

收稿日期：2019-04-28

基金项目：甘肃省自然科学基金（编号：1610RJZE141）。

作者简介：高义霞（1982—），女，甘肃白银人，硕士，副教授，主要从事资源植物的开发利用研究。E-mail：egaoxy@126.com。

我国是世界苹果产业规模最大的国家，2014年我国苹果栽培面积和年产量分别达到 226.67万hm2 和 3 800万t，疏果量达285万t[1];以甘肃省为例，苹果栽培面积和年产量分别达到 32万hm2 和320万t，疏果量约为24万t。而幼果中的多酚含量为成熟果实的10倍，约占幼果的 1%～2%，是苹果多酚丰富的来源，开发价值很高[2]。据专家预测，多酚的需求量将会以每年40%的速度增长。目前，茶多酚制品已形成相当的市场规模，相关研究发现，苹果多酚的许多生理功能比茶多酚要高100倍以上[3]，因此，开发苹果多酚制品具有广阔的销售市场。目前，绝大多数的苹果疏落果被丢弃，极少量以沼气或者饲喂家禽等方式消化，既污染了自然环境，也产生大量的农业垃圾，造成极大的资源浪费[4]。相关报道表明，苹果多酚混合物具有抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性，具体作用机制不清楚。高血压是威胁人类健康的“头号杀手”，2010年，我国高血压患者达2亿人，且每年以1千万人的速度增长，因此，如何有效预防高血压成为人们共同面对的挑战[5]。Tom等研究发现，血压升高与ACE活性有着密切的联系，抑制ACE活性可降压[6]，如人工合成的降压药卡托普利正是利用这一治疗机制，但副作用明显，因此，人们试图寻找天然的ACE抑制剂来开发天然降压药或具有降压保健功能的药食重组产品。目前，国内关于茶多酚对ACE活性的降压机制研究较为成熟，但关于苹果多酚抑制ACE活性的研究却鲜有报道。本研究将苹果多酚中单体酚作为指标成分，建立一种快速、简便、灵敏、准确、重复性好的检验方法，旨在为苹果多酚降血压活性指标的质量控制和血管紧张素抑制剂的药物研制提供试验依据。对苹果多酚的开发和利用不仅可以减少大量废弃苹果幼果资源浪费，而且可以变废为宝，减少环境污染，构建和谐文明社会，具有深远的现实意义和社会意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花牛苹果疏除幼果，采自甘肃省天水市麦积区中滩镇九龙山苹果基地，采集时间为2016年6月5日，处理前保存于0 ℃冷庫中。福林酚试剂（Folin-Ciocalteu），上海润顺化工有限公司;没食子酸标准品（≥99%），阿拉丁试剂;果胶酶（>500 AJDU/mg），Sigma公司;异抗坏血酸，湖南世纪华星生物工程有限公司;无水乙醇，国产分析纯。

KQ-500型超声波清洗器，昆山市超声仪器公司;紫外-可见分光光度计（UV-2450），日本岛津生产;九阳料理机（JYL-C022），九阳集团;TGL-20M 型高速台式冷冻离心机，湖南湘仪公司生产。

1.2 苹果多酚的提取

取花牛苹果幼果，切块后，按10 g ∶ 1 mL的比例（苹果样品：异抗坏血酸）加入10%异抗坏血酸水溶液作为护色剂，破碎后，精确称取样品10.000 g，加入1.7 mg果胶酶于50 ℃酶解2 h，按照料液比 1 g ∶ 10 mL 加入50%（体积分数，下同）乙醇，380 W 下微波提取2 min，提取次数2次，提取液抽滤，收集滤液，定容备用[7]。

1.3 标准曲线的制作及多酚含量的测定

多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法[8]。取0.1 g没食子酸标准品，用100 mL 50 %乙醇溶液溶解，摇匀后，分别取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 标准液，加入3 mL稀释3倍的Folin-Ciocalteu试剂，摇匀，反应2 min后加入2 mL 7.5 %碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，30 ℃保温30 min，740 nm处测定D值。标准曲线方程：y=0.088 7x+0.005 5，r2=0.9 993，式中：x为吸光度，y为没食子酸质量浓度（μg/mL）。苹果多酚含量的测定按同法操作。计算多酚含量的公式：多酚得率=C×V×N/m×100%，式中：C为测量液总酚质量浓度（μg/mL）;V为粗提液体积（mL）;N为稀释倍数;m为样品质量（g）。

1.4 苹果多酚的纯化

采用大孔树脂柱NKA-9，以丙酮为溶剂，柱层析初步分离苹果粗多酚。根据其对苹果多酚动态吸附、解吸附柱层析试验，每5 mL收集1次，氮吹浓缩后，通过理化性质进行鉴别。利用Sephadex LH-20进一步纯化分离精制，得到分离物质，与标准品对比，经高效液相色谱（HPLC）比对确定为5种单体酚[9-11]。

1.5 单体酚降血压活性研究

以对ACE的抑制能力为靶标，以降压药物卡托普利（ACE抑制剂）为阳性对照，体外研究苹果多酚各单体的降血压活性，筛选出活性明显的成分。基本方法为在模拟人体生理条件下，利用ACE催化水解马尿酰组氨酰亮氨酸生成马尿酸，当加入ACE抑制剂时，催化水解反应被抑制，生成的马尿酸含量减少。马尿酸在存在喹啉的条件下与苯磺酰氯反应生成黄色化合物，在乙醇溶液中最大吸收波长为470 nm，故可比色定量，根据马尿酸吸收值的大小来衡量ACE的抑制活性[12]。

2 结果与分析

2.1 苹果多酚的分离鉴定

利用大孔树脂柱NKA-9，分离得到4组成分，分别为FA、FB、FC、FD。组分FA通过Sephadex LH-20 分离（重复操作2次），分离洗脱曲线见图1-a，得到1个组分FA1（480.2 mg）。组分FC通过Sephadex LH-20分离（重复操作4次），分离洗脱曲线见图1-b。通过大孔树脂及Sephadex LH-20 分离（重复操作3次），最终得到4个组分FC1（182.0 mg）、FC2（273.6 mg）、FC3（123.6 mg）、FC4（1 079.0 mg）。由于组分FB、FD均为分离到的非有效的酚类物质，故弃去。

图2、图3为经过Sephadex LH-20进一步分离纯化所得到的高纯度产物色谱，图3为同等色谱条件下5种标准品混合溶液的HPLC结果。将图2与图3相对照，可知经大孔树脂初步分离，所得到的高纯度单一产物FA1可能是绿原酸，FC1可能是表儿茶素，FC2可能是根皮苷类，FC3可能是儿茶素，FC4可能是槲皮素。

2.2 苹果单体酚对ACE的抑制作用

以上述步骤分离的5种单体酚为研究对象，利用其对ACE的抑制作用，模拟人体生理条件，测定各单体酚对ACE的抑制作用，以其评价其降血压活性。

2.2.1 马尿酸标准曲线 参照文献[13]的测定方法，称取适量马尿酸标准品，分别配成含量为0.00、002、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16 mg/mL的马尿酸水溶液，向各管中加入0.6 mL喹啉，混匀后再加入0.2 mL苯磺酰氯，立即盖紧比色管塞，手动强烈振荡25～30次，在（30±2） ℃条件下避光放置30 min。加入3.7 mL 95%（体积分数）乙醇，混匀，继续避光放置30 min。用10 mm比色杯取中间浓度管扫描，确定最大吸收波长为470 nm，以试剂空白（0号管）为参比，在470 nm处测量各管的吸光度。最后以吸光度为纵坐标、马尿酸含量为横坐标，绘制马尿酸含量与混合溶液吸光度的标准曲线，详见图4。

2.2.2 卡托普利对ACE抑制作用 为了确立ACE的活性测定体系，进行不同浓度卡托普利对ACE抑制活性的测定。从图5可以看出，随卡托普利质量浓度不断增大，其对ACE的抑制作用不断增强，当卡托普利质量浓度增至100 μg/mL时，卡托普利对ACE的抑制作用不再明显增加，说明其趋于饱和，利用SPSS 16.0计算得出卡托普利对ACE的IC50为67.49 μg/mL。

2.2.3 不同抑制剂对ACE活性的抑制效果 根据上述方法，对每一种试剂在不同浓度下进行测定，研究不同浓度下各成分对兔肺ACE活性的影响，结果见图6。计算得绿原酸、根皮苷、儿茶素、槲皮素、表儿茶素IC50分别为138.43、38.23、68.28、28.33、62.09 μg/mL，表明槲皮素、根皮苷、儿茶素、表儿茶素具有明显的抑制ACE的作用，与阳性药物相比较，槲皮素和根皮苷的效果明显优于卡托普利，表儿茶素和儿茶素的效果与卡托普利相当。

3 结论

以花牛苹果疏果为材料，通过微波辅助提取苹果多酚，利用大孔树脂NKA-9对提取的粗多酚进行分离，再通过Sephadex LH-20进一步纯化分离精制，得到5种单体酚，分别为绿原酸、表儿茶素、根皮苷类、儿茶素、槲皮素。利用分光光度法测定各单体酚对血管紧张素酶的抑制效果，结果表明，槲皮素、根皮苷、儿茶素、表儿茶素具有明显的抑制ACE的作用，与阳性药物相比较，槲皮素和根皮苷的效果明显优于卡托普利，表儿茶素和儿茶素的效果与卡托普利相当。

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