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牛大力精油成分测定及其作用机制预测分析

2020-07-06李程勋李爱萍徐晓俞郑开斌

江苏农业科学 2020年10期
关键词:活性成分信号通路网络药理学

李程勋 李爱萍 徐晓俞 郑开斌

摘要:研究牛大力精油成分,并利用网络药理学方法初步分析其活性物质的作用机制。通过回流法提取牛大力精油,并利用固相微萃取技术对样品进行采集,气相色谱-质谱法(GC-MS)对样品成分进行测定,结合计算机谱库和人工谱图解析对样品成分进行鉴定,然后进一步利用药理学分析平台(TCMSP)结合类药五原则和口服生物利用度筛选出牛大力精油活性成分,通过PharmMapper数据库对活性成分的靶位点进行匹配,筛选出关键靶位点,通过DAVID数据平台对关键靶位点进行KEGG(京都基因与基因组百科全书)通路富集分析,利用Cytoscape软件构建活性成分-靶点-KEGG通路网络。共测得牛大力精油化学成分65种,包括醛类、醇类、酸类、烃类、酮类和酯类等化合物,筛选出13种活性成分,主要作用于16个靶位点上,通过KEGG分析得到6条通路。牛大力精油中的活性成分邻苯二甲酸二丁酯、水杨酸甲酯等有可能作用于GSK3B、PPP1CC等基因编码的靶位点上,参与调控胰岛素、多巴胺受体、蛋白聚糖等信号通路,从而对糖尿病、神经系统、肿瘤和癌症等进行调控。

关键词:牛大力;精油成分;网络药理学;作用机制;活性成分;靶位点;信号通路

中图分类号: R284.1  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2020)10-0217-07

收稿日期:2019-05-16

基金项目:福建省科技重大专项(编号:2018NZ0003-2)。

作者简介:李程勋(1991—),男,福建南安人,硕士,研究实习员,主要从事作物品质育种与天然产物提取研究。E-mail:1219513539@qq.com。

通信作者:李爱萍,研究员,主要从事作物遗传品质育种及农产品天然产物提取研究,E-mail:apl909@163.com;郑开斌,博士,研究员,主要从事作物遗传品质育种及农产品天然产物提取研究,E-mail:k03163@163.com。

牛大力是豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的根,别称大力薯、倒吊金钟、金钟根、山莲藕等。常被用于中药中,药用价值较大,有补虚润肺、强筋活络之效,能够治疗肺热、肺虚、肺结核、慢性肝炎、风湿性关节炎等疾病[1]。传统中对于牛大力的应用多是基于其含有丰富的蛋白质、淀粉、生物碱、多种黄酮类化合物等,而对于牛大力挥发性成分的研究和应用几乎没有,明确牛大力精油的成分组成及其作用机制对于牛大力精油的利用具有重要指导意义,同时也可为其他中药精油的开发和利用提供参考。近年来,国内外对植物精油的研究十分活跃,植物精油中含有丰富的芳香族、脂肪族等活性物质,具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤等多种功效,已从肉桂[2]、佛手[3]、姜黄[4]、金银花[5]、月桂、茴香、香菜[6]等大量植物中研制出了相应的精油。陈建烟等对植物精油的抗菌、抗癌、抑制肿瘤细胞生长等多种生物活性的作用机理进行了综述[7];朱丽云等综述了抗癌活性植物精油的主要活性成分及其作用机制[8]。国内外关于牛大力的研究主要集中在牛大力的栽培管理、药理作用、化学成分分析和功效成分分离鉴定上,其中,郑海等在广东省开展了牛大力优质高产种植技术研究[9];陈晨等通过高效液相色谱(HPLC)、ICP-MES等方法测定了海南牛大力中维生素、氨基酸和矿质元素等营养成分[10];宗鑫凯等通过柱层析方法从牛大力95%乙醇提取物中分离得到异甘草素、高丽槐素、紫檀素、美迪紫檀素、高紫檀素[11];Zhao等通过单因素试验和响应面法优化了牛大力总黄酮的提取方法,并证明了牛大力提取物具有较强的抗氧化活性[12];Yin等从牛大力中分离出了一种新的黄酮醇苷[13];齐耀群等研究表明,牛大力多糖通过促进IκB-α蛋白和抑制NF-κB p65蛋白的表达,降低了炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的释放,从而起到抗炎作用[14]。目前,对于牛大力精油成分和功效作用方面的研究几乎没有,在一定程度上限制了牛大力精油的开发利用。本研究采用气相色谱-质谱(GC-MS)法对回流提取得到的牛大力精油成分进行鉴定分析,并利用网络药理学方法预测分析牛大力精油成分的功效作用及作用机制,以期为牛大力精油的开发应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

试验材料为牛大力根切片,取自广西中医药大学。

试验仪器为GCMS-TQ8040气相色谱质谱联用仪(日本岛津公司);手动固相微萃取(SPME)迸样器、固相微萃取头[50/30 μm二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS),美国色谱科公司];顶空萃取瓶(20 mL,美国安捷伦科技公司);精油回流提取器(25 L)。

1.2 試验方法

1.2.1 牛大力精油提取 将牛大力根切片置于挥发油提取罐中,按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸馏水,回流提取4 h,待油水分离器中油和水分离完全后,将牛大力精油分离出来。

1.2.2 SPME萃取和GC-MS分析方法 第1步,将固相萃取头置于丙酮中浸泡30 min;第2步,将固相萃取头接在气相色谱仪进样口处老化30 min(老化温度为250 ℃);第3步,移取5 mL牛大力挥发油置于20 mL顶空萃取瓶中,插入老化好的固相萃取头吸附30 min(吸附温度为60 ℃);第4步,将吸附完成后的固相萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口中解吸附3 min(250 ℃),并进行数据采集。GC条件:Rxi-5Sil MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温:柱温50 ℃维持2 min后,以 5 ℃/min 的速度升温至180 ℃,再以20 ℃/min的速度升温至 280 ℃,维持2 min;载气为纯氦气,流量为1 mL/min,分流比为10 ∶ 1;进样量为1 μL。质谱条件:电子轰击电离(EI)源(电子能量为 70 eV),接口温度为280 ℃,离子源温度200 ℃,质谱扫描范围为35~550 aum[15]。

1.2.3 数据处理和分析 挥发油各成分经过气相色谱-质谱分离,通过计算机谱库(NIST/WILEY)检索和分析后,再进行人工谱图分析,最终确定挥发油中各个化学成分,采用峰面积归一化法得到各成分的相对含量。

1.2.4 牛大力精油活性成分筛选 结合中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),通过类药五原则(化合物成药的必需条件)和口服生物利用度(OB>30%),筛选出牛大力精油中的活性成分。类药五原则具体内容为(1)相对分子质量<500;(2)氢键供体数目<5个;(3)氢键受体数目<10个;(4)油水分配系数<5;(5)可旋转键的数量不超过10个。符合类药五原则的化合物成分会有更好的药代动力学性质,在生物体内的代谢过程中有更好的生物利用度,更有可能成为口服药物[16]。

1.2.5 牛大力精油活性成分作用靶点的预测与筛选 通过PubChem平台查找牛大力精油活性成分的三维化合物结构图,保存为“sdf”格式。将活性成分三维化合物结构图以“sdf”格式输入PharmMapper数据库中进行靶点匹配预测(将靶点集设置为仅人类蛋白质靶点),将预测结果导出,并按对接得分Z值进行排序,每个成分选取前30个靶点用于后续研究[17-19]。

1.2.6 牛大力精油活性成分-预测靶点网络构建 将牛大力精油活性成分和预测靶点信息导入Cytoscape 3.6.1软件中,构建活性成分-预测靶点网络,以探究牛大力精油的药理学作用机制。Cytoscape 3.6.1是一个可以将互作网络可视化的软件,主要包括节点和连接,每个节点可以是分子、蛋白质或基因等,节点和节点之间的连接代表这些分子之间的相互作用。每一个节点都有一个度值,度值代表着节点与节点相连的数目,度值越大,则这个节点在网络中的作用越大,如果该节点是靶点,则该靶点极有可能是化合物的关键靶点[20]。

1.2.7 KEGG通路富集分析 将活性成分-预测靶点网络中节点度值大于等于5的靶点蛋白利用DAVID数据库进行KEGG(京都基因与基因组百科全书)生物通路富集分析,筛选出P≤0.05的通路,利用Cytoscape软件构建活性成分-靶点-KEGG通路网络[16]。

2 结果与分析

2.1 牛大力精油化学成分分析

通过GC-MS方法共检测出牛大力精油化学成分65种(表1),对其成分进行统计,结果见图1。

由表1、图1可知,共测得化学成分65种,其中醛类化合物有13种,相对含量最高,达44.11%;醇类化合物次之,有8种,相对含量为16.27%;酸类化合物有3种,含量为14.73%;烃类化合物有12种,含量为7.96%;酮类化合物有15种,含量为 4.30%;酯类化合物有8种,含量为2.74%。

2.2 牛大力精油活性成分筛选

采用类药五原则和口服生物利用度从牛大力精油中共筛选出13种活性成分,具体见表2。

结合表1、表2可知,13种活性成分相对含量总和为48.35%,其中醛类相对含量最高,达到 27.20%,酸类含量为13.64%,醇类含量为5.19%,酮类含量为1.34%,酯类含量为0.98%。在牛大力精油成分中,活性成分相对含量占了接近50%。

2.3 牛大力精油活性成分-预测靶点网络构建

通过PharmMapper数据库预测牛大力精油活性成分的靶点,采用Cytoscape 3.6.1软件制作活性成分-预测靶点网络图。由图2可知,牛大力活性成分-预测靶点相互作用网络共有177个节点, 包括13个化合物节点和164个靶点节点,在作用网络中有16个靶点度值≥5,说明这16个靶点能与5个及以上化合物发生相互作用,具体靶点信息见表3。

2.4 牛大力精油关键靶点KEGG信号通路富集分析及活性成分-靶基因-通路网络构建

通过DAVID数据平台对牛大力精油关键靶点进行KEGG通路富集分析,以P≤0.05为条件筛选出6条信号通路(表4)。进一步利用Cytoscape软件构建牛大力精油活性成分-靶基因-KEGG通路网络(图3)。

由图3可以看出,牛大力精油通过13种活性成分作用于6个关键的靶位点上,调控着6条重要的信号通路。由表4可以看出,关键靶点主要涉及的通路有抗胰岛素信号通路、胰岛素信号通路、多巴胺受体信号通路、EB病毒感染信号通路、癌症中蛋白聚糖的信号通路、细胞的焦点黏连信号通路。由涉及的通路可以看出,牛大力精油对于糖尿病、神经系统调节、肿瘤、癌症等具有一定的调控作用。

3 讨论与结论

3.1 牛大力精油对糖尿病的作用机制预测

牛大力現已被广泛应用在预防和治疗糖尿病的药方中,贺勤杰将牛大力作为1种主要成分,结合丹参、天花粉等中药在糖尿病治疗中一起发挥作用[21];赵志祥等发现,由牛大力、当归、熟地黄等组成的脉复生合剂对于治疗糖尿病足的临床疗效显著[22]。袁永春等发明了一种由牛大力、千里光、苦地丁等组成的治疗糖尿病足的护理液[23];李送南发明的牛大力枸杞茶也具有治疗糖尿病的功能[24]。本研究预测牛大力精油中的邻苯二甲酸二丁酯、水杨酸甲酯、己醛、4-庚酮、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、壬酸、己酸、1-壬醇等成分可作用于由GSK3B、PTPN1、PPP1CC基因编码的靶位点上,参与调控抗胰岛素信号通路和胰岛素信号通路,对胰岛素合成起到双向调控的功能,因此对糖尿病具有调控作用。

3.2 牛大力精油对神经系统调节机制预测

牛大力与其他药物复配能够治疗坐骨神经痛[25]、改善腓神经运动神经传导速度和感觉神经传导速度[22]、调节神经系统[26]等。本研究预测牛大力精油中的邻苯二甲酸二丁酯、水杨酸甲酯、己醛、4- 庚酮、壬酸、2-十一烯醛、薄荷醇、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、1-壬醇等成分可作用于由MAPK14、GSK3B、PPP1CC基因编码的靶位点上,参与调控多巴胺受体信号通路,具有通过神经递质调控中枢神经系统的生理功能。

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