王帆 刘小莉 王兴娜 李春阳 周剑忠

摘要：初步研究肉桂醛对生鲜湿面中霉菌的气相抑制作用，从生鲜湿面中分离纯化出6种优势腐败霉菌，18S rDNA分子鉴定结果表明，其中将2种青霉属的霉菌鉴定为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和扩展青霉（Penicillium expansum），3种曲霉属的霉菌鉴定为灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）和白曲霉（Aspergillus candidus），1种毛霉属的霉菌鉴定为总状毛霉（Mucor racemosus）。肉桂醛采用气相扩散法和固相扩散法测定时均对生鲜湿面中的霉菌表现出抑制作用，其中青霉属和曲霉属的菌种对肉桂醛的敏感性较毛霉属菌种高。将肉桂醛置于生鲜湿面包装袋的密闭空间内，通过其自身的挥发性来抑制霉菌的生长，经气相浓度为200 μL/L的肉桂醛处理后可将生鲜湿面在28 ℃下贮藏的货架期延长35 d，说明肉桂醛具备开发成为一种气相抑菌剂的潜力。

关键词：生鲜湿面;肉桂醛;霉菌;气相抑制;分子生物学鉴定;货架期;抑菌圈

中图分类号： TS213.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0214-03

收稿日期：2019-05-17

基金项目：江苏省农业科学院农产品加工研究所科研基金项目[编号：JG（2017）05]。

作者简介：王 帆（1983—），女，江苏南京人，硕士，助理研究员，主要从事食品微生物的研究。E-mail：wangfan713@126.com。

生鲜湿面是指压延成型后未经干燥处理的面条，因具有较干挂面更佳的风味口感而受到消费者青睐，日本、美国、中国以及东南亚各国等已实现生鲜湿面的产业化生产[1]。生鲜湿面水分含量高，在流通和贮藏过程中易出现霉变现象，目前生产中主要采用减菌加工与化学保藏的方法延长产品的货架期。然而化学药物残留在食品中会对人体造成危害，存在安全隐患。因此，研究开发安全高效的新型植物源抑菌剂替代传统化学抑菌剂是生鲜湿面工业化生产中亟待解决的问题。

肉桂醛（Cinnamaldehyde），别称3-苯基-2-丙烯醛，主要存在于樟属植物中，是肉桂提取物肉桂油的主要成分，已被广泛运用于食品、化妆品和医药领域[2]。研究表明，肉桂醛对多种细菌、真菌均具有较高的抑制活性[3-5]。但是肉桂醛具有特殊的气味，如果直接添加到食品中会改变食品的风味和口感，因此其应用受到限制。利用肉桂醛容易挥发到空气中变为气相的特性，将其置于食品贮藏的密闭空间内，通过其自身的挥发性来有效抑制生鲜湿面中霉菌的生长和繁殖，不需要直接与食品接触即可达到抑菌的作用。肉桂醛作为一种天然植物源化合物，具有高安全性和广谱抑菌性，若能将其在食品加工业上开发为新型抑菌剂，可能会有巨大的研发和应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

生鲜湿面（淮安唯新食品有限公司）;肉桂醛（国药集团化学试剂有限公司）;马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（北京路桥技术有限责任公司）;霉菌基因组DNA提取试剂盒（Solarbio Fungi Genomic DNA Extraction Kit D2300，北京索莱宝科技有限公司）;引物NS1、NS6、Premix Tap（Ex Taq Version 2.0 plus dye，RP902A）由日本宝生物工程株式会社提供。

1.2 方法

1.2.1 生鲜湿面中霉菌的分离纯化及初步鉴定 采用无菌操作方法取25 g霉变的生鲜湿面样品加入 225 mL 生理盐水中，梯度稀释制备成菌悬液，取100 μL稀释液用涂布法接种到PDA培养基上，在28 ℃下培养5 d。从得到的分离菌种中挑取形态各异的特征菌落，点种到新的PDA培養基上，在28 ℃下培养 5 d，必要时可以反复进行上述操作，直至获得纯化的单菌落。观察并记录菌落特征，在光学显微镜下用低倍镜和高倍镜观察菌丝形态及孢子囊类型，参照GB 4789.16—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 常见产毒霉菌的形态学鉴定》等对霉菌种类进行初步鉴定。

1.2.2 生鲜湿面中霉菌的分子生物学鉴定 将分离纯化的霉菌，用霉菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。取5 μL提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将有明显条带的DNA放置于-20 ℃下保存待用。采用真菌DNA扩增通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）进行18S rDNA基因的PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：模板DNA 1 μL，正反向引物（25 μmol/L）各1 μL，Premix Tap 25 μL，加灭菌去离子水补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，38个循环;72 ℃延伸5 min。反应结束后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增片段长度与目的片段长度（1300 bp左右）相同并且无杂带后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。将获得的霉菌18S rDNA序列结果提交到NCBI的BLAST网页（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中，在GenBank数据库中进行BLAST同源比对，对菌种进行分子生物学分析鉴定。

1.2.3 肉桂醛对霉菌的气相抑制作用测定 选取生鲜湿面中的优势霉菌，在PDA平板上于28 ℃下培养 5 d 后，刮取孢子放入加有适量灭菌水的三角瓶中，用2层无菌纱布过滤去除菌丝后，加入灭菌玻璃珠振荡摇匀，制备成孢子悬液，用血球计数板将孢子悬液的浓度调整为1×105个/mL。采用气相扩散法测定肉桂醛对霉菌的抑制作用，方法参照文献[6]。取100 μL孢子悬液均匀涂布于PDA平板上，待菌液被吸收后倒置放置，制成含菌平板。分别吸取不同体积（2、4、8、16 μL）的肉桂醛，均匀滴加在无菌滤纸片上，置于皿盖内侧中心形成气相氛围，使得培养皿中肉桂醛的空间含量分别为25、50、100、200 μL/L（9 cm培养皿的体积约为80 mL），将各培养皿盖好用封口膜密封，在28 ℃下培养3～5 d后，采用十字交叉法测量抑菌圈大小。固相扩散法和气相扩散法的操作大致相同，只是将含有不同体积肉桂醛的无菌滤纸片置于含菌平板中心。试验结果的判定标准：抑菌圈直径>15 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，<7 mm 为不敏感[7]。

1.2.4 肉桂醛对生鲜湿面的气相防霉作用测定 将肉桂醛溶液均匀滴加在无菌滤纸片上，置于生鲜湿面包装袋的密闭空间内，使得包装袋中肉桂醛的空间含量为200 μL/L（每100 g生鲜湿面的包装体积约为200 mL），以相同空间含量的乙醇为阳性对照，未加药液的滤纸片为空白对照。根据NY/T 1512—2014《绿色食品 生面食、米粉制品》中生面食制品菌落总数≤3×105 CFU/g的要求，测定生鲜湿面在28 ℃下贮藏的货架期。

2 结果与分析

2.1 生鲜湿面中霉菌的分离纯化及初步鉴定

从生鲜湿面中共分离纯化出6种优势腐败霉菌，通过观察菌落特征、显微镜下的菌丝形态和孢子囊类型，初步鉴定出霉变菌种分为3个菌属，其中2种为青霉属，3种为曲霉属，1种为毛霉属，其特征描述见表1。根据其一般来源和生长特性，可以判断生鲜湿面中大部分种类的霉菌是由原料中污染的霉菌或孢子萌发而成的，而少部分种类的霉菌则是在生产加工的过程中进入产品的。

2.2 生鲜湿面中霉菌的分子生物学鉴定

以霉菌基因组DNA为模板，采用引物NS1和NS6对18S rDNA序列进行扩增，将扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳，发现在1 300 bp处出现条带。对测序后的扩增产物在GenBank数据库中进行BLAST同源比对，得到基因序列最为接近的已知霉菌菌株序列，序列相似度≥99%时视为同一种菌，其中将2种青霉属的霉菌鉴定为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和扩展青霉（Penicillium expansum），3种曲霉属的霉菌鉴定为灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）和白曲霉（Aspergillus candidus），1种毛霉属的霉菌鉴定为总状毛霉（Mucor racemosus）。6种霉菌与GenBank数据库中已登记菌株的18S rDNA序列同源性均≥98%，菌株登录号及名称见表2。

2.3 肉桂醛对霉菌的气相抑制作用测定

从表3可以看出，采用气相扩散法和固相扩散法均测得肉桂醛对生鲜湿面中的6种霉菌具有抑制作用，且随着加入药液体积的增加，抑制效果也逐渐增强。各稀释度的肉桂醛对青霉属（A、B）和曲霉属（C、D、E）的5种霉菌均具有很强的抑制作用，虽然采用气相扩散法的抑制效果比固相扩散法弱一些，但是2种抑菌方式的抑菌圈直径均>15 mm，说明青霉属和曲霉属的菌种对肉桂醛高度敏感。毛霉属菌种对肉桂醛的敏感性不如青霉属和曲霉属的菌种强，采用固相扩散法时抑菌圈直径>15 mm，为高度敏感，采用气相扩散法时仅16 μL药液处理的抑菌圈直径大于15 mm，为高度敏感，其他药液处理的抑菌圈直径均在10～15 mm 之间，为中度敏感，这可能是由不同菌属之间的差异所决定的。

2.4 肉桂醛对生鲜湿面的气相保鲜作用测定

生鲜湿面在28 ℃下贮藏的菌落总数变化规律见表4。根据NY/T 1512—2014《绿色食品 生面食、米粉制品》中生面食制品菌落总数≤3×105 CFU/g的要求，未经任何处理的生鲜湿面在28 ℃下的货架期仅为7 d，当菌落总数超过105 CFU/g时，生鲜湿面出现肉眼可见的黄绿色霉點;经气相浓度为 200 μL/L 的乙醇处理后，生鲜湿面的货架期可延长至14 d;经气相浓度为200 μL/L的肉桂醛处理后，生鲜湿面的货架期可延长至42 d，且最先出现的霉变为白色菌丝。由此进一步验证了肉桂醛对生鲜湿面中的霉菌具有气相抑制效果，对青霉属和曲霉属霉菌的抑制作用较毛霉属霉菌强。

3 结论与讨论

本研究初步探讨了肉桂醛对生鲜湿面中霉菌的气相抑制作用。从生鲜湿面中共分离纯化出6种优势腐败霉菌，通过观察菌落特征、显微镜下的菌丝形态和孢子囊类型，初步鉴定出霉变菌种分为3个菌属，其中2种为青霉属，3种为曲霉属，1种为毛霉属。将分离纯化的霉菌，用霉菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用真菌扩增通用引物NS1和NS6对18S rDNA序列进行扩增，将扩增产物测序后在GenBank数据库中进行BLAST同源比对，最终将2种青霉属的霉菌鉴定为产黄青霉和扩展青霉，3种曲霉属的霉菌鉴定为灰绿曲霉、阿姆斯特丹曲霉和白曲霉，1种毛霉属的霉菌鉴定为总状毛霉，6种霉菌与GenBank数据库中已登记菌株的18S rDNA序列同源性均≥98%。采用气相扩散法和固相扩散法测定肉桂醛对生鲜湿面中6种霉菌的抑制作用，结果表明，不同体积（2、4、8、16 μL）的肉桂醛采用气相扩散法和固相扩散法测定时对生鲜湿面中的霉菌均表现出抑制作用，其中青霉属和曲霉属的菌种对肉桂醛的敏感性较毛霉属菌种高。将气相浓度为200 μL/L的肉桂醛置于生鲜湿面包装袋的密闭空间内，通过肉桂醛自身的挥发性来抑制霉菌的生长，测定生鲜湿面在28 ℃下贮藏的货架期，结果发现，未经任何处理的生鲜湿面在28 ℃下的货架期仅为7 d，经气相浓度为200 μL/L的肉桂醛处理后可将生鲜湿面的货架期延长35 d，说明肉桂醛具备开发成为一种气相抑菌剂的潜力。

参考文献：

[1]宋显良，邓学良，周文化. 生鲜湿面防霉保鲜技术[J]. 食品与机械，2013，29（2）：159-162.

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[3]Alzoreky N S，Nakahara K. Antibacterial activity of extracts from some edible plants commonly consumed in Asia[J]. International Journal of Food Microbiology，2003，80：223-230.

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[5]Cheng S S，Liu J Y，Hsui Y R，et al. Chemical polymorphism and antifungal activity of essential oils from leaves of different provenances of indigenous cinnamon （Cinnamomum osmophloeum）[J]. Bioresource Technology，2006，97（2），306-312.

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[7]岳淑丽，任小玲，陈 霞，等. 桉叶精油包埋前后抑菌性能及成分比较研究[J]. 食品科学，2017，38（11）：155-160.