张健 王沙沙 张文娥 潘学军

摘要：为了探索不同形态的氮素及氮素的不同配比对泡核桃（Juglans sigillata Dode.）试管苗生根的影响，采用以DKW为基础培养基配方，对大量元素中的铵态氮（NH+4-N）和硝态氮（NO-3-N）比例进行调整，研究氮素形态及配比对泡核桃生根率的影响。结果表明，DKW培养基中不添加铵态氮（NH+4-N ∶ NO-3-N为0 ∶ 5）可获得较高的生根率（71.75%）和生根条数（2.67条），明显高于对照（NH+4-N ∶ NO-3-N为1 ∶ 4），提高DKW基本培养基中铵态氮的含量可制约泡核桃组培苗的生长，最后使整棵小植株死亡;大量元素中的K、Mg及微量元素中的Mn、Cu、B对泡核桃试管苗的生根可能起到了重要作用;生根试管苗采用珍珠岩和营养土两步炼苗，60 d后成活率达到92.00%。

关键词：泡核桃;培养基调配;试管苗;生根

中图分类号： S664.104+.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0176-06

收稿日期：2019-05-20

基金項目：贵州省科技重大专项子课题[编号：黔科合重大专项字（2011）6011]。

作者简介：张 健（1994—），男，安徽临泉人，硕士研究生，主要从事果树种质资源与生物技术育种研究。E-mail：1047607911@qq.com。

通信作者：潘学军，博士，教授，主要从事果树种质资源与生物技术育种研究。E-mail：pxjun2050@aliyun.com。

植物组织培养技术作为工厂化育苗的重要手段，因其再生技术具有遗传稳定、繁殖系数高、繁殖率稳定、条件可控等特点已得到广泛应用，且发展前景广阔[1]。然而，核桃属（Juglans Linn.）植物是难生根的经济林树种，我国于20世纪80年代初就已开始对核桃试管苗微繁殖的研究，到90年代在生根方面已取得了一定进展[2-4]，但核桃组培苗的生根问题一直是制约其工厂化育苗的瓶颈。因此，如何提高核桃试管苗的生根率成为广大学者研究的热点，有研究表明，核桃树体中的高含量酚类物质被氧化成核桃醌，是导致核桃属植物难生根的主要因素[5-6]，所以，相比其他树种，核桃试管苗的生根比较困难，且因根系发育不良导致吸收功能较弱，这些都限制了核桃试管苗的移栽成活率。运用植物生长调节剂和暗处理是诱导核桃根原基形成的重要措施[7-8]，但是生根效果因种或品种不同而差异显著，因此探索新方法解决核桃试管苗生根问题和提高移栽成活率成为研究的关键。

氮素是植物体内核酸、蛋白质、维生素、酶以及生物碱等次生代谢产物的重要组分，是影响植物生长发育及产量和品质的重要因素，在植物生命活动过程中具有重要的生理调节功能。一般来说，植物对氮素的需求量高于其他各种元素，氮素的主要作用是促进植物营养生长，提高光合能力，保证其正常生长发育。与此同时，氮素也是植物生理代谢过程中起催化作用的主要物质。大多数的植物都是以土壤中的有机以及无机态的氮素作为氮源，只有部分植物是通过根瘤菌等固氮类的微生物固定大气中的氮元素作为氮素的来源。铵态氮与硝态氮是植物吸收的主要氮素形态，一些可溶性的有机氮（如尿素、氨基酸等）也是植物可以吸收及利用的。而不同的氮素形态对植物的生长及代谢过程有显著差异，进而会对植物产生不同的生理效应。

本试验以我国核桃特有种（泡核桃）的试管苗为材料，从调配DKW基本培养基中的氮元素入手，尝试推测泡核桃根系在发生发育过程中对不同氮素形态的喜好，以及对不同元素在其生根中可能起到的重要作用，为核桃属植物及难生根木本植物的生根研究提供科学的理论和技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在贵州省果树工程技术研究中心进行。试材为在组织培养室内继代增殖20 d的泡核桃试管苗。

1.2 试验设计

以DKW培养基的配方为基础，对大量元素中的铵态氮（NH+4-N）和硝态氮（NO-3-N）比例进行调整，设置处理1（100% NO3-N）、处理2（25% NH+4-N+75% NO3-N）、处理3（40% NH+4-N+60% NO3-N）、处理4（50% NH+4-N+50% NO3-N）、处理5（60% NH+4-N+40% NO3-N）、处理6（75% NH+4-N+25% NO3-N）、处理7（100% NH+4-N），即NH+4-N和NO-3-N的配比分别为 0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1和5 ∶ 0。这7个处理均按DKW基本培养基的配方分别加入微量元素、有机元素及铁盐。

1.3 试验方法

1.3.1 DKW基本培养基中铵态氮和硝态氮配比对泡核桃嫩茎生根的影响 以DKW培养基的配方为基础，对大量元素中的NH+4-N和NO-3-N比例进行调整，设置两者的比例为0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1、5 ∶ 0，其微量元素、有机元素和铁盐保持不变。其中，1 ∶ 4的处理（即DKW培养基的原始配方）为对照。采用“两步生根法”进行生根，第一步诱导培养基为7种不同配比的DKW培养基，并分别附加5.0 mg/L IBA，暗培养12 d转入生根培养基;第二步生根培养基为不含生长调节剂的7种不同配比的DKW培养基，进行光培养20 d后统计生根率和生根条数。共7个处理，以上各处理均接种60瓶，每瓶2个外植体，每20瓶为1个重复，重复3次。

1.3.2 泡核桃生根苗与未生根苗的营养元素含量的测定 在获得不同NH+4-N和NO-3-N配比（0 ∶ 5、1 ∶ 4、1 ∶ 1）的生根苗和未生根苗之后，以这3个处理的生根试管苗为材料，测定其全株的营养元素含量。其中，1 ∶ 4的处理为对照。在测定3个处理的生根苗和未生根苗中的营养元素含量时，首先将不同处理的生根苗和未生根苗从培养基中取出，分别小心地去掉根系和愈伤上的培养基，再按以下顺序对样品进行洗涤：自来水→0.1%中性洗涤剂溶液→2次自来水→3次蒸馏水→2次重蒸水，整个洗涤过程不超过2 min，然后将样品置于105 ℃烘箱内杀青30 min，并在80 ℃条件下烘至恒质量，最后用塑料粉碎机将样品粉碎，过65目尼龙筛后，装入密封袋保存备用。样品的测定方法如下：N含量用凯氏定氮法测定，P含量用钒钼黄比色法测定，K含量用火焰光度计法测定;Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn含量用原子吸收分光光度计法测定，B含量用姜黄素比色法测定[9]。

1.3.3 泡核桃生根苗的炼苗移栽 选取根长2 cm以上，有2～3条根，苗高4～5 cm的生根试管苗，在强光（3 000 lx）下锻炼7 d后，无菌条件下将生根苗从培养基中取出，用无菌水洗净根部培养基，0.1% KMnO4浸根10 s，移栽至盛有灭菌珍珠岩的营养钵中，浇灌100 mL 1/8 DKW营养液（以后每隔7 d浇1次），加盖与营养钵同样大小的塑料杯（保持湿度）后，放入培养室中培养2～3 d后，浇灌4%的多菌灵（以后每隔7 d浇1次）。培养室温度为（25±1） ℃，培养初期光照时间为12 h/d，15 d后增至 16 h/d。培养室煅炼30 d，地上部叶色加深后转移到盛有营养土的营养钵中进行温室锻炼，生长30 d左右，移栽到大田定植。

1.4 培养条件

上述不同NH+4-N和NO-3-N配比的生根培养基中，1 L均添加20 g蔗糖和6 g琼脂，pH值为5.8～6.2。培养温度为（25±1） ℃，光周期为 16 h/d，光照度为40 μmol/（m2·s）。

1.5 数据统计分析

采用Excel軟件统计数据，并用DPS v7.05软件进行数据处理和统计分析。

生根率=诱导生根茎段数/原接种茎段数×100%;

生根条数即每茎段平均生根数;

移栽成活率=移栽成活数/总移栽数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同铵态氮和硝态氮配比对泡核桃嫩茎生根的影响

由表1可知，7种不同NH+4-N和NO-3-N配比对泡核桃嫩茎的生根率、生根条数和根系生长情况影响显著。当配比为0 ∶ 5时，生根率和生根条数最高，分别为71.75%和2.67条，显著高于其他处理，其根细长，叶绿色，生长正常;配比为1 ∶ 1时的生根率为57.50%，显著高于配比为1 ∶ 4的（48.50%），而两者的生根条数无差异，分别为1.67和1.25条，根粗壮;当配比为2 ∶ 3、3 ∶ 2、4 ∶ 1和 5 ∶ 0 时，嫩茎的生根率和生根条数均为0，且叶片干枯凋落，最后整株死亡，这是由于NH+4浓度高时出现了氨中毒现象。说明，NH+4-N和NO-3-N的适宜配比（0 ∶ 5）有利于泡核桃试管苗的生根，生根率明显高于DKW原始配方（处理1 ∶ 4），而NH+4-N含量稍高即可制约泡核桃组培苗的生长，使整棵小植株死亡（图1-A至图1-E）。从配比为0 ∶ 5和 5 ∶ 0 的根生长情况可以看出培养基中N素的形态对根的诱导有明显的影响。当配比为0 ∶ 5和1 ∶ 4时的根生长情况可以看出单一的N素不如2种混合使用的效果好。

2.2 不同铵态氮和硝态氮配比对试管苗大量元素含量的影响

由表2可见，NH+4-N和NO-3-N配比为0 ∶ 5时，泡核桃生根苗和未生根苗的N含量之间无显著差异，P含量间有较小差异，达不到显著水平，而K、Ca、Mg含量间存在显著差异。其中，生根苗的K含量（4.53%）显著高于未生根苗（4.35%），而Ca和Mg的含量（0.87%和0.09%）显著低于未生根苗（0.96%和0.13%）。当NH+4-N和NO-3-N配比为1 ∶ 4和1 ∶ 1时，生根苗的N、P、Ca、Mg含量明显低于未生根苗，而两者的K含量之间无显著差异。由于NH+4-N和NO-3-N配比为0 ∶ 5时获得了泡核桃试管苗的高生根率（71.75%），而该配比的生根苗中的K含量最高，Mg含量最低，且差异显著，因此，试验初步认为大量元素K和Mg对泡核桃试管苗的生根起到了重要作用。

2.3 不同铵态氮和硝态氮配比对试管苗微量元素含量的影响

通常植物以NH+4-N为氮源时，有利于对阴离子的吸收，而以NO-3-N为氮源时，有利于对阳离子的吸收，这是由于植物吸收NH+4和NO-3后体内保持电荷平衡所决定的。由表3可见，NH+4-N和NO-3-N配比为0 ∶ 5时，泡核桃生根苗中的Fe、Mn、Cu、B含量显著高于未生根苗，而两者的Zn含量之间无差异;当配比为1 ∶ 4时，生根苗的Fe、Mn、Cu、B含量与未生根苗存在明显差异，而Zn含量之间无差异。其中，生根苗的Mn含量（145.08 mg/kg）显著高于未生根苗（127.48 mg/kg），而Cu、Fe、B含量明显低于未生根苗;配比为1 ∶ 1时，生根苗和未生根苗的Fe、Mn、Zn、B含量之间差异显著，而两者的Cu含量之间无明显差异。由于NH+4-N和NO-3-N配比为0 ∶ 5（生根率71.75%）的生根苗中的Mn、Cu、B含量较其他处理最高，且差异显著，因此，试验认为以NO-3-N为主要氮源时，泡核桃对以阳离子为主要吸收形态的Mn、Cu等元素的吸收积累量提高，说明微量元素Mn、Cu、B可能对泡核桃试管苗的生根起到了重要作用。

2.4 泡核桃试管苗的驯化移栽

参照潘学军等的葡萄炼苗移栽方法[10]，温室中珍珠岩炼苗30 d后，泡核桃生根苗的成活率为100%;转入营养土炼苗30 d最后定植于大田，成活率为92.0%（图1-G、1-H）。

3 讨论与结论

植物组织培养中，培养基主要是提供植物组织生长和维持发育的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。起初在培养基的使用方面，主要有Whites、Chengs、MS和B5等类型，这些培养基所含的营养成分及浓度不同，其中，MS培养基的主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富，元素平衡性好，缓冲性好，微量及有机成分含量齐全且较丰富，是目前使用最广的培养基;Whites为低无机盐含量培养基;B5为高硝酸钾含量培养基[11]。总体上来说，培养基类型多种多样，应用比较广泛，但各种不同培养基都有自身的优点和不足，没有任何一种培养基能够满足所有植物的养分需求，因此，有些学者开展了培养基调配的研究，如Driver和Kuniyuki研制出了核桃的专用培养基（DKW培养基），并广泛用于核桃属植物的组织培养上[4]。DKW培养基主要用于木本植物的组培，用于不同培养目的（增殖或生根）时，只需将其中的生长调节剂水平或个别营养成分做适当调整，即可获得令人满意的结果，如袁巧平等又对DKW培养基中的一些营养成分作了适当调整并获得了适宜于普通核桃生长的改良DKW培养基[12]，这个培养基也被许多学者采纳并应用[13-14]。车代弟等以花粉萌发率和花粉管的长度作为求算培养基组分的衡量指标[15]，与花粉在活体中的生长情形相近，优化获得的培养基配方效果较好，这对于研究者有针对性地解决植物组培工作中的某个难点有一定启发。

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