刘玲 唐仕成 郑丹 柯皓天 吕银

摘要：采用正交试验设计L16（45）对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明，各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系，即在10 μL反应体系中，含25 ng/μL DNA模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。优化得到的反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，合适的退火温度退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，40个循环;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。通过梯度PCR，确定引物ID37的退火温度为49.5 ℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。

关键词：桑树;正交试验设计;ISSR-PCR;反应体系优化

中图分类号：S888.2   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）10-0080-05

收稿日期：2019-05-15

基金项目：四川省科技计划（编号：2019YJ0291）。

作者简介：刘 玲（1989—），女，山西大同人，硕士，工程师，主要从事桑树分子标记工作。E-mail：liuling1022@yeah.net。

桑树是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）多年生木本植物，是重要的经济植物，桑叶是家蚕的主要饲料。我国地域辽阔，生态环境各异，经长期的自然选择和人工选育，形成了非常丰富的桑树种质资源。研究桑树的遗传多样性及其亲缘关系对桑树的栽培育种、良种选育等有重要意义。

简单重复序列间扩增（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）标记是一种基于微卫星序列发展起来的分子标记，以PCR技术为基础，利用真核生物基因组中广泛存在的微卫星序列设计引物，对2个距离较近、方向相反的SSR序列之间的基因组片段进行扩增。ISSR分子标记技术结合了RAPD和SSR分子标记的优点，稳定性和重复性好，多态性高。国内外众多研究者已将ISSR分子標记技术应用于桑树种质资源的遗传多样性研究等方面[1]。

本研究参考以往桑树ISSR研究，采用正交设计和极差分析结合的方法，对桑树ISSR-PCR反应体系中的5个因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，进行4个水平优化，并对反应程序中的变性时间、退火时间、延伸时间和循环次数进行正交设计优化，以期建立适合于桑树ISSR分析的PCR反应体系，为ISSR分子标记在桑树上更广泛地应用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自四川省丝绸科学研究院桑树种质资源圃。选择品种资源“团桑10号”作为PCR反应体系、反应程序和引物退火温度优化的模板。

扩增引物参考由加拿大英属哥伦比亚大学UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子标记在桑树方面的应用研究结果[2]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。经初步试验，选择扩增片段清晰的引物ID37（5′-GAGGAGGAGGAGGC-3′）作为建立反应体系的固定引物。PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×buffer均购自TaKaRa公司。

1.2 基因组DNA提取及质量检测

基因组DNA提取参照CTAB法，从约0.15 g硅胶干燥的嫩桑叶中提取。DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度用微量紫外分光光度计检测确认。

1.3 ISSR-PCR反应体系的建立及优化

PCR反应体系中的5个因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，每个因素分别设置4个水平（表1）。采用L16（45）正交设计（表2），共16组反应体系。每组还含有1 μL 10×buffer。优化模板为团桑10号，引物为ID37，每个反应体系设2次重复。

对正交设计试验结果进行直观分析和极差分析，确定2种方法各自的最佳反应体系;若结果不同，则分别对这2种体系进行PCR扩增，根据电泳结果确定哪种反应体系效果更好。

PCR反应在Thermal Cycler（上海山富科学仪器有限公司）上进行。初始反应体系（总体积10 μL）：25 ng模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.1 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL，加ddH2O至 10 μL。初始扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性60 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，40个循环;72 ℃延伸10 min，反应结束控制在12 ℃。PCR反应产物经1.5%琼脂糖电泳检测后，在紫外投射反射仪下观察拍照保存。每个反应重复2次。

1.4 ISSR-PCR反应程序的正交试验

采用优化好的反应体系对PCR扩增程序中的变性时间、退火时间、延伸时间和循环次数进行优化，这4个因素水平设置见表3，扩增程序的优化采用L9（34）正交试验设计（表4），每个组合重复扩增2次。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，对结果进行直观分析，确定最终的PCR反应程序。

1.5 引物退火温度优化

以确定的最佳反应体系为基础，以提取的“团桑10号”DNA作为模板，对引物ID37的退火温度进行优化筛选，退火温度设定范围为47～53 ℃，PCR仪自动生成12个温度。PCR扩增后产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增结果确定引物ID37（表5）的最佳退火温度。

1.6 桑树ISSR-PCR最佳反应体系稳定性验证

用8个桑树材料：团桑5号、江油12-3、江油19号、江油22号、江油24号、江油402、江油椹1号、白桑，用引物ID7（表5）对优化出的反应体系做稳定性检测，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR正交反应体系的直观分析

由图1可知，除组合2和组合3外，其余各组扩增条带都存在条带缺失和不清晰的情况。与第3组相比，组合2的扩增条带清晰度弱，因此，电泳结果认为第3组合为最优体系，即DNA模板第1水平、引物第3水平、Mg2+第3水平、dNTPs第3水平、rTaq酶第3水平，即10 μL反应体系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物 0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.3 μL。

为了进一步证明对试验结果初步判断的准确性，根据李志勇等对正交设计试验中的各组分浓度组合进行K值等分析[3]，分析结果见表6。K值代表某水平下某因子参与反应所产生的扩增条带的总和;k代表某因子在某水平下参与反应所产生的扩增条带的平均值;R为某因子的极差，即某因子在不同水平下最大平均值与最小平均值之差。

R值的大小反映了该因子对试验结果影响的大小，R值越大，影响越显著。根据极差R分析可知，本研究中的5个因素在设定的4个水平内对试验结果的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

k值反映了影响因素各水平对反应体系的影响情况，k值越大，反应水平越好。模板DNA第1水平最好，引物第3、4水平最好，Mg2+第3水平最好，dNTPs第3水平最好，rTaq酶第1水平最好。即极差分析得到2种最佳反应体系（引物量不同），分别命名为极差1和极差2，每个组合的组分用量如表7。

2.2 正交设计直观分析和极差分析结果比较

对正交第3组、极差1和极差2的反应体系作PCR扩增并直观比较。从图2中可以看到，极差1和极差2的扩增效果差不多，谱带亮度强，多态性高且比较稳定，都明显好于正交第3组。反应体系极差1与极差2相比，区别只是引物量少一些。从节约角度考虑，选择极差1为最佳反应体系，即10 μL反应体系中含25 ng/μL模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L 引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 08 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 01 μL。

2.3 扩增程序优化

采用优化好的反应体系优化桑树ISSR-PCR扩增程序，结果如图3所示。从电泳结果来看，不同组合扩增条带的深浅、优劣不同。第1、2、4、8、9组合条带模糊，不好辨认;第3、5、6、7组合条带相对清晰，其中第3组合条带最好辨认。因此，选择第3组合为桑树ISSR-PCR的扩增程序，即94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40个循环;72 ℃延伸10 min，反应结束后 16 ℃保存。

2.4 引物退火温度筛选

由图4可见，退火温度对PCR扩增结果影响明显。当温度高于49.5 ℃时，扩增条带不清晰或者条带不全;温度低于49.5 ℃时，扩增条带清晰、完全;因此，选择49.5 ℃为引物ID37的退火温度。大多数ISSR引物适合较高的退火温度，且能提高 ISSR-PCR反应的特异性及精确度[4]，故在47.0～49.5 ℃范围内，选择了略高的49.5 ℃来退火。

2.5 最佳反应体系和程序稳定性检测

采用优化得到的ISSR-PCR反应体系，用引物ID7对8个桑树基因组DNA样品进行扩增反应，以检测优化得到的最佳反应体系和反应程序的稳定性，检测结果如图5所示。

由图5可见，引物ID7从8份种质材料中扩增的条带清晰、稳定、多态性高。表明，经过优化后建立的ISSR-PCR反应体系及程序具有较好的稳定性。

3 讨论与结论

本研究通过直观分析和正交极差分析对比筛选出的最佳体系，结果表明，正交极差分析得到的2组反应体系效果都好于直观分析效果。直观分析带有一定的主观性，极差分析是通过计算将结果转换成数字，能更好地对比出各个因素间的相互作用[5]。

本研究优化得到的桑树ISSR-PCR反应体系为10 μL反应体系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。5个因素在设定的4个水平内对试验结果的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

桑树ISSR-PCR反应体系仅见思彬彬等在2012年采用正交试验设计和单因素设计结合的方法优化过[6]，得到的优化体系为25 μL中10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+ 2.5 mmol/L、rTaq 0.05 U/μL、引物0.4 μmol/L、DNA 4 ng/μL。本研究与之相比，5个因素的浓度只有rTaq和引物相同，可能是由于试验材料、引物、浓度梯度設置和技术要求不同造成的。

同时，本研究还采用正交试验设计优化了桑树ISSR-PCR反应程序中的变性时间、退火时间、延伸时间和循环数，通过电泳检测PCR产物，得到最适桑树ISSR-PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 变性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40个循环; 72 ℃延伸10 min， 反应结束后16 ℃保

存。稳定性检验结果表明，得到的反应体系和程序能够扩增出清晰的条带。

本研究得到的反应体系和程序可用于桑树ISSR分析，为桑树系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。

参考文献：

[1]周延清. DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社，2005：144-149.

[2]陈仁芳，刘 玲，钱永华，等. 北方蚕区89份桑种质资源的ISSR标记遗传多样性分析[J]. 蚕业科学，2015，41（3）：410-416.

[3]李志勇，李鸿雁，孙启忠，等. 正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究[J]. 华北农学报，2010，25（6）：97-103.

[4]闫 林，黄丽芳，谭乐和，等. 咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化[J]. 热带作物学报，2012，33（5）：854-859.

[5]张龙进，白成科. 正交设计优化北重楼ISSR-PCR体系[J]. 植物研究，2011，31（1）：105-108.

[6]思彬彬，刘明丽. 桑叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 安徽农业科学，2012，40（3）：1329-1331.