宁科功 赵信义 伍 鹏 王 舟 高 鹰

(1.云南白药股份有限公司，云南 昆明；2.空军军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)

牙齿是人体最为坚硬的矿化组织。在人口腔环境中，正常情况下牙釉质表面处于脱矿-再矿化动态平衡中，维持了牙齿硬组织的结构、形态和功能。但是在某些情况下，牙釉质表面脱矿-再矿化动态平衡被病理因素打破，脱矿超过了再矿化，导致釉质表面矿物质缓慢丢失，出现诸如牙齿龋坏、酸蚀症等牙齿疾病[1]。在这种情况下，需要通过外界干涉来减小牙齿表面的脱矿，或者促进再矿化来修复牙齿的脱矿[2]。口腔护理用品，特别是牙膏，是人们每天都要使用的洁齿产品，赋予牙膏具有牙齿硬组织再矿化功能一直是人们追求的目标[3]。目前国内外市售的许多牙膏声称具有牙齿硬组织再矿化功能，对于这些牙膏的评价和管理已经成为行业协会一项紧迫的任务，但是国内一直缺少体外评价牙膏促进牙釉质再矿化有效性的标准方法。国际上虽然有许多关于牙齿再矿化研究的论文，但是所采用的方法复杂，测试过程步骤多、时间长，更适合于牙齿再矿化的学术研究，例如机制研究。本研究基于单纯体外评价牙膏促进牙釉质再矿化有效性为目的，研究出一种方法简单、步骤少、时间短的牙釉质体外再矿化有效性试验方法，以为建立相关行业标准奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新鲜牛切牙近1个月拔出的牛切牙，拔出后浸泡于生理盐水中于4℃冷藏保存。

1.1.2 牙齿脱矿液配方[4]0.1 mol/L乳酸，30g/L羧甲基纤维素，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为4.2。

1.1.3 人工唾液的配方[4]1.5mmol/L CaC12，0.9mmol/L KH2PO4，130mmo1/L KCl，1.0mmol/L NaN3、20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。

1.1.4 含氟牙膏配方摩擦剂水合二氧化硅、湿润剂甘油，表面活性剂月桂醇硫酸，粘合剂羧甲基纤维素钠盐，香精薄荷醇，氟化钠。共配制氟含量分别为0.05%、0.1%、0.15%三种含氟牙膏。

1.1.5 无氟牙膏配方 与1.4中的含氟牙膏基本相同，只是不含氟化钠。

1.2 方法

1.2.1 釉质试块的制备选择新近拔除的牛切牙，去除牙根及釉质表面污物。用低速金刚石切割机切割成4mm×5mm×2mm的釉质块，用环氧树脂包埋并暴露唇面釉质(图1)。然后分别用#800、#1200、#2000碳化硅水砂纸在注水下依次磨抛釉质面和试块底面，充分暴露釉质面并使釉质面与试块底面平行。最后用0.3μm氧化铝抛光液进行抛光，使釉质表面平整且为镜面状，在体视显微镜下检查无明显的划痕。

1.2.2 釉质块表面硬度测定在维氏显微硬度计上测定釉质的表面硬度，载荷100g，保荷15s。每个釉质块表面测定5个点，均匀分布于釉质表面，以均值表征釉质初始表面硬度(SH0)。

1.2.3 釉质块的表面脱矿将每个试样分别置于盛有15ml脱矿液(1.1.2)的带盖塑料瓶中，将塑料瓶置于37℃恒温箱中静置脱矿30min～10hs。脱矿后取出釉质试块，去离子水冲洗、吹干后测定表面维氏硬度，方法同1.2.2，以均值表征釉质脱矿后表面硬度(SH1)。

1.2.4 脱矿釉质试块的分组及处理将釉质块按照脱矿后硬度由大到小排列，按照硬度值均衡分配原则将试样分为7组，每组10个试样。七个实验组为：无氟牙膏刷牙组、0.05%氟牙膏刷牙组、0.15%氟牙膏刷牙组、无氟牙膏浸泡组、0.05%氟牙膏浸泡组、0.1%氟牙膏浸泡组、0.15%氟牙膏浸泡组。

无氟牙膏刷牙组:脱矿釉质试块釉质表面每天用无氟牙膏刷牙两次(早上8∶00、晚上19∶00)，每次刷牙1分钟，浸泡1分钟，刷牙用软毛旋转电动牙刷(THOMAS)(图2)，刷牙压力75g，牙膏浆以牙膏∶去离子水=1∶2(质量比)比例配置，经高速分散机分散均匀。刷牙后釉质试块用去离子水冲洗、吹干，放入盛有15ml人工唾液(1.1.3)的带盖塑料瓶中，将塑料瓶置于37℃恒温箱中进行再矿化处理。此过程连续进行两周。

图2 釉质试块安放在硅橡胶凹面底座中(a)，凹面加入牙膏浆，用电动牙刷对釉质表面进行磨刷，牙刷磨头配有砝码(b)，磨刷压力为75g。

0.05%氟牙膏刷牙组和0.15%氟牙膏刷牙组：方法同无氟牙膏刷牙组，只是使用的牙膏浆分别是含0.05%氟的牙膏和含0.15%氟的牙膏。

无氟牙膏浸泡组：脱矿釉质试块每天用无氟牙膏浆浸泡两次(早上8∶00、晚上19∶00)，每次2分钟。牙膏浆以牙膏∶去离子水=1∶2(质量比)比例配置，经高速分散机分散均匀。牙膏浆用量：10个试样/10ml,浸泡时牙膏浆处于摇动状态(图3)。浸泡后釉质试块用去离子水冲洗、吹干，放入盛有15ml人工唾液(1.1.3)的带盖塑料瓶中，将塑料瓶置于37℃恒温箱中进行再矿化处理。此过程连续进行两周。

图3 釉质试块浸泡牙膏浆

0.05%氟牙膏浸泡组、0.10%氟牙膏浸泡组及0.15%氟牙膏浸泡组：方法同无氟牙膏浸泡组，只是使用的牙膏浆分别是含0.05%氟的牙膏浆、含0.10%氟的牙膏浆和含0.15%氟的牙膏浆。

1.2.5 再矿化后的硬度测定各组釉质试块在连续处理2周后对釉质表面的硬度进行测定，方法同1.2.2。以均值表征釉质再矿化后表面硬度(SH2)。

1.2.6 再矿化后脱矿釉质试块表面硬度恢复率的计算[5]以下式计算釉质试块再矿化后表面硬度恢复率(SHR%)：

SHR%=[(SH2-SH1)/( SH0-SH1)]×100

1.2.7 统计学分析对各实验组数据进行统计学分析，组间差异比较选用单因素方差分析(ANOVA)，组间均数两两比较采用SNK-q检验。

2 结果与讨论

2.1 牙釉质的脱矿方式与脱矿时间

图4是釉质试块放入脱矿液中于37℃水浴中，分别进行静置脱矿和摇晃脱矿3h后的表面硬度变化柱状图，可见未脱矿前釉质块表面硬度基本相同，脱矿3h后，静置脱矿的釉质表面硬度降低至111.7kg/cm2，而摇晃脱矿的釉质表面硬度降低至51.2kg/cm2。研究发现，釉质表面硬度低于90kg/cm2时，显微硬度计在高倍镜(×400)下压痕轮廓变得模糊，难以测量压痕尺寸，需要在低倍镜(×100)下测量，增加了数值转换过程。

图4 静置脱矿与摇晃脱矿3h后釉质的表面硬度

对于静置脱矿来说，在脱矿的3h内，脱矿时间与釉质表面硬度的关系见图5，可见脱矿最初1.0h内，釉质表面硬度下降较快，1.0h后硬度下降减缓。

图5 静置脱矿时间与硬度的关系

2.2 牙釉质脱矿后在人工唾液中的再矿化效果曲线

图6是初始表面硬度为335kg/cm2的釉质静置脱矿3.0h后硬度变化及在37℃人工唾液中静置浸泡(每24h更换新鲜人工唾液)6天(144h)过程中釉质表面硬度的变化情况，可见脱矿后的釉质经过在人工唾液中浸泡后，釉质表面硬度有大幅度增加，再矿化效果非常明显，特别是在浸泡人工唾液的最初24h内，釉质表面硬度增加幅度最大，24h后表面硬度增加显著减缓，说明在人工唾液浸泡的最初24h，脱矿的釉质再矿化效果最为明显，浸泡24h后，再矿化效果显著减缓。这一结果与文献报道一致[5]。

图6 牙釉质脱矿后在人工唾液中的再矿化效果曲线

2.3 牙膏浆浸泡与刷牙对脱矿釉质再矿化的影响

图7是脱矿釉质每天分别用4种牙膏浆浸泡2分钟2次，其他时间浸泡于人工唾液中，连续进行2周后脱矿牙釉质的硬度恢复率，经统计学分析，0.10%氟及0.15%氟牙膏浆浸泡组的硬度恢复率显著高于无氟牙膏和0.05%氟组(P<0.05),而无氟牙膏浆组与0.05%氟牙膏浆组的硬度恢复率无显著性差异(P>0.05)。0.10%氟及0.15%氟牙膏浆浸泡组间比较，差距无统计学意义(P>0.05)。

图7 脱矿釉质每天牙膏浸泡2次2周后釉质硬度恢复率

图8是脱矿釉质每天早、晚分别用3种牙膏浆刷牙1分钟+浸泡1分钟，其他时间浸泡于人工唾液中，连续进行2周后脱矿牙釉质的硬度恢复率，经统计学分析，3个实验组的釉质硬度恢复率的差异无统计学意义，说明用牙膏刷牙，无法判别含氟牙膏的再矿化优势。

图8 脱矿釉质每天牙膏刷牙2次2周后釉质硬度恢复率

图9是脱矿牙釉质表面未刷牙(左侧)与刷牙(右侧)部分的表面三维形貌(A)及蓝线处的表面轮廓线(B)。可见，在脱矿釉质表面刷牙部分釉质表面有不均匀的实质性损失，说明刷牙过程磨掉了牙釉质表面脱矿后的表面层。

图9 脱矿牙釉质表面未刷牙(左侧)与刷牙(右侧)部分的表面三维形貌(A)及蓝线处的表面轮廓线(B)

3 讨论

3.1 关于釉质脱矿硬度

在进行体外再矿化试验时，需要对牙釉质表面进行脱矿，脱矿到什么程度是人们关心问题。我们认为，脱矿的程度首先要有利于脱矿后硬度的测定，现有的釉质硬度测定均采用显微硬度计进行测定，常用的是维氏(Vicker′s)硬度或者努氏(Knoop′s)硬度，这两种硬度压痕极小，需要在高倍显微镜下测定压痕尺寸。如果釉质脱矿程度太大，在硬度计高倍镜下压痕轮廓会模糊不清，影响压痕尺寸测定的准确性。根据我们的经验，釉质表面维氏硬度低于90kg/cm2时，高倍镜下压痕尺寸测定精度会显著下降，需要在低倍镜下测定压痕尺寸，需要通过倍数换算确定硬度值，增加了工作量，因此釉质脱矿后维氏硬度最好不要低于90kg/cm2。

釉质脱矿后的硬度也不能太高，现有的研究表明，釉质脱矿后的再矿化效果(硬度恢复率)与脱矿后釉质硬度有关，较低硬度的釉质再矿化后的硬度恢复率较高。参考相关文献，我们认为釉质脱矿后的维氏硬度最好在100～160kg/cm2范围内。

3.2 关于再矿化试验方法

文献中有许多牙釉质再矿化试验方法[7-9]，用于不同的再矿化研究中，其中pH循环法(pH cycling model)是一种脱矿-再矿化循环法，模拟人口腔中酸碱度变化情况。但是这种方法需要较长的时间(15～30天)，而且每天的操作步骤多，工作量大。作为评价洁齿剂促进脱矿牙釉质再矿化有效性的体外试验方法，应当具有试验时间短、操作步骤少、便于大通量进行、能够展示再矿化有效性的特点，而人工唾液浸泡法也是常用的、有效的再矿化方法[10]。鉴于此，我们认为洁齿剂的再矿化试验方法采用人工唾液浸泡方法。从本研究的结果来看，人工唾液的浸泡具有显著的再矿化效果，特别是在浸泡最初的24h，再矿化效果非常显著。

关于再矿化试验的时间，从图6可见，牙釉质脱矿后浸泡于人工唾液后，在最初的24h内釉质的表面硬度增加幅度最大，24h后至第5天，釉质硬度仍然有缓慢增加，第5天后增加幅度很小。基于这样的现象，我们建议牙釉质体外再矿化试验时间定位5～6天为宜。

3.3 关于洁齿剂施加方式

评价洁齿剂促进脱矿牙釉质再矿化的有效性是本研究建立体外试验方法的核心。本研究评价了洁齿剂浸泡和洁齿剂刷牙两种方式，以公认的能够促进牙齿再矿化的含氟牙膏作为试验的阳性对照，以无氟牙膏作为阴性对照。结果表明，用含0.10%和0.15%氟的牙膏浆每日早、晚各浸泡2分钟，可以显著促进釉质的再矿化，表现在釉质硬度恢复率显著大于阴性对照的无氟牙膏和含0.05%氟的牙膏，这一结果与许多文献报告一致[11,12]。说明本研究采用的再矿化方法及洁齿剂施加方法是有效的。而用牙膏刷牙的施加方法，由于会磨除硬度降低的表面釉质层而不能展现釉质的再矿化效果，因此建议不要使用刷牙方法来评价洁齿剂促进再矿化的有效性。

3.4 关于洁齿剂促进脱矿牙釉质再矿化有效性的判定

关于洁齿剂促进脱矿牙釉质再矿化的体外试验方法，我们建议设立阴性对照组、阳性对照组和实验组，阴性对照组的洁齿剂采用不具有促进脱矿牙釉质再矿化的配方组成物，例如仅含有基本成分的洁齿剂，不含任何活性成分。而阳性对照应当采用已经证明有促进脱矿釉质再矿化的洁齿剂，例如本研究中的氟含量不低于0.10%的含氟洁齿剂，设立阳性对照的目的是确保试验过程的有效性，只要阳性对照组的釉质硬度恢复率高于阳性对照，说明试验过程是有效的。测试中，只要受试产品组(实验组)经过5天的再矿化试验，其釉质硬度恢复率显著高于阳性对照组(P<0.05),即可判定受试产品具有促进脱矿釉质再矿化的能力。