李奕阳

摘 要：CRISPR-Cas系统是一种对生物物基因组定点编辑技术。因为它操作简单、成本低、耗时短等优点，从而逐渐取代锌指核酸酶（ZFNs）TALE核酸酶 （TALENs），成为对目标基因进行高效、定点编辑的技术，引起生物科学界的巨大变革。本文介绍了CRISPR-Cas9系统的作用原理和优势，指出尚未解决的问题，结合其在各个国家的研究现状，展望CRISPR-Cas9系统的应用前景。

关键词：CRISPR-Cas9;基因编辑;基因治疗

0 引言

原核生物基因内的一段重复序列称为CRISPR，是其在长期而复杂的进化过程中获得的对抗病毒侵入的免疫工具。概括地说，病毒通过对自身的基因整合进入细菌体内完成侵入，并利用细菌体内的蛋白质等物质进行复制繁殖，而细菌演化出CRISPR-Cas9系统，抵抗这种侵入。通过CRISPR-Cas9系统，细菌可以将自身基因内病毒侵入的片段进行切除，从而实现免疫防御。

细菌拥有多种手段切除病毒的遗传信息，通过合成一种特殊的复合物进行切除的方法最为常见，该复合物可以定向地寻找特定的基因序列，之后进行定点切除。该复合物在细菌体内较为复杂，有Cas9蛋白参与基因组的定点编辑，这种技术被命名为CRISPR/Cas9基因编辑技术，在当下拥有非常广阔的科研前景，并且逐渐开发完善。此系统具有低成本、易操作、精准度高、周期短等优点[1]。

1 CRISPR系统简介

CRISPR技术具有改变生物科技领域基本规则的能力，这种系统主要分为两个部分，具有引导功能的sgRNA以及具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白，CRISPR-Cas9系统的科研前景非常广阔，可以改变生物的遗传物质达到改变性状的目的，通过对植物的基因组定点编辑加强该植株对某种特定病毒的抵抗能力;通过修复细胞DNA治疗特定遗传病等。

CRISPR是在微生物的免疫系统中发现的，通过对Cas9酶的利用，能在DNA中插入作为引导序列的RNA，之后实现切除DNA片段等目的。有研究表明，sgRNA的加入，能更有效地让基因组产生突变，效率比以往的传统基因编辑手段要高。虽然具有高效性和广泛的适应性，但是CRISPR-Cas9技术在目标细胞的编辑中依旧会产生“脱靶效应”，各科研机构仍在寻找有效的改进方法。

从20世纪90年代初CRISPR技术被发现，到七年后首次应用在生物工程领域，CRISPR技术迅速地发展成为各大领域主要的基因组定点编辑的新工具。2012年，研究人员发现了一种强大的基因组编辑技术对生物DNA进行修饰，并命名为CRISPR。美国约翰·霍普金斯大学医学院证明，这个技术可以应用于人体干细胞的编辑。这一发现有利于更简捷地修饰诱导多功能干细胞的基因组，加速了该技术进行临床实验的进程，并被发表于《分子治疗》上。2015年1月6日，为了研究人体内其他细胞是否能进行这样的操作，研究小组分别用CRISPR和TALEN在人体的IPSCs上进行试验，方法是切下已知基因片段或切下后换上指定序列。将JAK2、SERPINA1和AAVS1基因设定为模型，通过JAK2基因的变异会引起骨髓紊乱，真性红细胞增多症;SERPINA1基因变异会导致alpha1-抗胰蛋白酶缺乏，这是一种遗传性紊乱，会造成肺和肝脏疾病;而AAVS1最近发现是人类基因组中的“安全港”，可以插入外来基因[2]。

通过比较发现，在这三个基因系统中，如果只是简单地切掉部分基因，CRISPR系统明显比TALEN更有效，产生的剪切效率远大于后者;在替换基因时，如替代JAK2和SERPINA1中的致病变异，CRISPR和TALEN的效率相差无几。研究人员指出，与癌细胞研究不同的是，无论CRISPR还是TALEN，在人体中都有着指定的目标，即不会替换其他基因。还发现，CRISPR系统的优势在于：CRISPR可以只瞄准变异的基因，而不伤害其他细胞中健康的等位基因。若该发现成功地与干细胞的研究相结合，就可以使CRISPR成为目前风险最小的人体IPSCs基因编辑手段。约翰·霍普金斯大学医学院导师叶朝辉说：“干细胞技术正在迅速发展。我们认为，将iPSCs用于人类治疗的日子已经不远”。他们的研究详细说明了如何将CRISPR技术用于人类iPSCs，展现了该技术在这类细胞中的研究潜力。

中国科研团队对CRISPR系统的研究和应用进行得如火如荼。2014年，南京大学的研究人员成功编辑猴的基因，这是历史上首次成功编辑非人类灵长目动物的基因。2016年8月，四川大学华西医院肿瘤学家卢铀带领团队首次进行对人体使用CRISPR技术进行基因编辑和临床应用。这些研究人员计划招募一批保守治疗已经无望的非小细胞肺癌患者。从患者身体血液中提取免疫细胞，利用CRISPR定向清除肿瘤的新基因序列，然后再把这些细胞注入患者的血液，成为新的抗体，2018年7月，CRISPR基因编辑实验在中国进行，并将尝试使用CRISPR技术来破坏人类乳突瘤病毒（HPV）的基因，并有效地降解入侵病毒，据悉，人类乳突瘤病毒已被证实可促使宫颈癌肿瘤生长[3]。

1.1 CRISPR-Cas9系统结构与分类

CRISPR-Cas9系统由tracrRNA序列区、cas基因序列区、crispr序列区三个功能部分组成。CRISPR系统主要分为三大类：Type I、Type II、Type III，而在化脓链球菌中发现的Cas9基因属于Type II，根据系统中包含的Cas基因种类的不同，又将Type II再细分为三种亚型：Type IIA、Type IIB、Type IIC。通常Type II型系统通常包括Cas9、Cas1、Cas2基因和CRISPR序列。

1.2 CRISPR-Cas9系统原理

CRISPR-Cas9免疫系统能夠有效保护细胞，当病毒二次侵入细胞时，整合了该病毒基因片段的crispr位点经转录会形成crRNA（不成熟的crRNA），成熟的crRNA会与加工过的tracrRNA招募Cas蛋白形成二元复合体，完成之后，与病毒的DNA特异位点互补配对结合，Cas蛋白就会切割靶DNA造成DSB，从而实现Cas9核酸酶对结合位点进行切割。

CRISPR-Cas9系统在目标基因的特异位点引入双链结构切割后，细胞可以通过两种主要的形式对该缺口进行修复。一种主要的修复机制是非同源染色体的末端连接，另一种方法是利用外源性修复模版作为参照，对同源DNA的修复则更加准确地进行，从而实现特定的基因片段插入或替换。更为重要的是，对比现有的基因编辑手段，CRISPR技术对基因的编辑是具有遗传性的，通过改变亲本的基因序列，经过有性繁殖之后的子代也会拥有相同的基因序列，从而实现永久地消除基因缺陷，换言之就是永久地免疫该类病毒。近些年来，CRISPR的基因编辑已经在动物身上试验并取得巨大的成功，并且在人类遗传疾病上得到了更加深入的尝试。重点是，在病毒的基因序列被Cas蛋白整合进自身序列中的时候，需要靶序列后面跟随PAM。在II型CRISPR系统中，NGG的三碱基序列通常构成PAM，这是使用CRISPR技术的唯一限制条件，即细胞基因内含有GG的碱基序列[4]。而在人体中，通过遗传分析可知道，每8个碱基对就会出现一次GG碱基序列，所以可以认为在人体上使用CRISPR技术并不受任何原理上的限制。

外显子测序和全部基因编码的测序极大的促进了一些罕见遗传病的研究进程和对单基因突变的筛查。据研究显示，绝大多数遗传病是由其致病基因特定外显子的点突变造成的。在基因转录的过程中，点突变可以将生物信号进行剪切或者停止发出，从而阻碍对应的mRNA或者蛋白质的合成或特定功能的丧失。因此，通过CRISPR-Cas9系统在特定点突变位置附近引入DNA双链切口，并且通过后续的同源或非同源修复作用，从而实现对突变引起的家族遗传病进行特定的修复。

1.3 CRISPR系统相关应用

2014年，Yin等人发表了利用CRISPR/Cas9技术介导的HDR来修复Fah基因点突变治疗遗传性高酪氨酸血症的研究。在该疾病的研究中，研究人员设计了多个靶向的Fah基因第8号外显子的gRNA，其与Cas9基因序列共同构建至质粒，并成功表达。该治疗策略取得了很大的成功。因此这个方案在类似的家族遗传病的研究上也进行了尝试。例如对新生小鼠注射cas9系统和DNA模板有关病毒，成功地修复了小鼠OTC基因第4号外显子的G→A的点突变。在上述实验中，通过cas9系统对目标点突变进行修复的效率并不相同[5]。一般认为，虽然基因序列的修复效率与HDR的效率成正比，但后者的发生概率要远小于前者，因此设计合适的gRNA模版更为重要。

2 展望

CRISPR系统依靠sgRNA分子将目的基因导向特定DNA位点，利用Cas9酶编辑DNA，以扰乱基因或插入目的基因。在实验时，研究人员需要订购的只是RNA片段，其他成分都是现成的。全部花费只有30美元，这是该技术走进更多实验室的重要原因。CRISPR方法几乎完胜锌指核酸酶技术和其他编辑工具。对一些研究人员来说，这意味着要放弃数年来完善的技术。一些研究人员严重依赖诸如小鼠、果蝇等模式生物。CRISPR使在更多生物体中编辑基因成为可能。

CRISPR基因编辑技术的发展已经进行到现代生物学各项领域，但也存在一定局限性。在2015年3月，一个研究小组在《自然》杂志发表公开信，提出“严重担忧”编辑人类基因“种系”产生的伦理道德和安全问题。研究人员对此方面仍有所顾虑，他们认为大量噬菌体侵入人体免疫系统会引发免疫系统的非正常反应，或者会令一些细菌更快地产生耐药性或者使耐药性大幅增强。相信未来随着科学研究逐渐进步，会出现符合人类需求的手段對基因编辑技术有更加深入的探究。

参考文献

[1] 李君，张毅，陈坤玲，等.CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J].遗传，2013，35（11）：1265-1273.

[2] 刘思也，夏海滨.一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J].中国生物工程杂志，2013，33（10）：117-123.

[3] 俞珺瑶，杜华平.CRISPR-Cas系统的研究进展及应用[J].生物技术通讯，2018，29（03）：422-429.

[4] 康峰，卢胜明，张海峰.CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J].实验动物科学，2014，31（4）：54-58.

[5] 吴彩云，罗秉轮，孙玉强.基因组编辑新技术：CRISPR/Cas系统在生物基因组学中的研究进展[J].植物生理学报，2015，51（12）：2063-2069.