黄思嘉，祝梦琦，李鹏程，张智英，魏泽辉

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

产蛋性状是家禽生产的重要经济性状之一，产蛋性能的高低主要取决于鸡卵泡发育过程中的卵泡选择和优先等级建立[1]。鸡的卵泡选择主要通过下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarianaxis, HPOA)与神经内分泌系统相互协调作用，并由生殖激素和一系列功能基因调控。抗缪勒氏管激素(anti-müllerian hormone, AMH)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族BMP/GDF/AMH亚家族的成员之一[2]，在鸡的卵泡发育过程中起着重要作用。

禽类的AMH在雌性胚胎和雄性胚胎的性腺中均有表达，但在雄性胚胎中AMH的表达量更高，主要起到使雄禽双侧缪勒氏管和雌禽右侧缪勒氏管退化的作用[3-4]。有研究表明，在鸡的卵泡发育过程中，AMH的表达量随着卵泡发育而降低，尤其是在卵泡选择后AMH的表达量显著下调，直至在F1的颗粒细胞中几乎不表达[5]，这表明AMH与卵泡选择密切相关。然而，目前还没有研究能够清楚地解释AMH在调控鸡卵泡选择过程中的具体分子机制。

TGF-β家族成员主要通过两个相关的Ser/Thr激酶Ⅰ型受体和Ⅱ型受体结合生成异二聚体复合物进行胞外至胞内的信号转导。在配体与跨膜Ⅱ型受体结合后，Ⅰ型受体被募集与Ⅱ型受体形成受体复合物，激活下游Smad蛋白进而调控目的基因的表达[6]。作为TGF-β家族的成员之一，AMH信号转导与其他成员相似，其Ⅱ型受体(anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor, AMHR2)是AMH目前唯一已知的Ser/Thr激酶Ⅱ型受体，在刚出生的雌性胎儿卵巢中即有表达并贯穿卵泡发育的整个过程[7-8]。近年来，已有学者对鸡的AMHR2基因结构及功能展开了研究。Ayers[9]通过转录组测序从头组装并与其他物种的基因组序列进行校准得到了鸡的AMHR2基因序列。Cutting[10]通过比对鸡AMHR2基因与Pfam数据库中其他物种AMHR2基因的对应区域，鉴定了鸡AMHR2基因中配体结合、跨膜、激酶、磷酸化受体和DNA结合区域的序列。其中，配体结合域包含几个高度保守的半胱氨酸残基，符合TGF-β家族受体的特征。AMHR2在未进行性别分化和正在分化的雌性和雄性鸡胚的性腺和缪勒氏管中均有表达，在鸟类性别分化过程中发挥重要作用[10]。Mishina[7]通过试验发现，缺乏AMHR2表达的雄性小鼠缪勒氏管的退化程度相对于正常雄性小鼠减弱。另外，Imbeaud[11]发现AMHR2基因突变可能会导致持久性缪勒氏管综合症。以上试验均验证了AMHR2在AMH信号转导中的重要性，因此敲除AMHR2基因能够阻碍AMH的信号转导，进而影响AMH在鸡卵泡发育和卵泡选择中的作用。

近年来，CRISPR/Cas9技术逐渐发展成熟，已在禽类基因组的特异性敲除试验中成功应用[12-13]。本研究通过构建靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除载体，在鸡的基因组上对AMHR2基因进行精确敲除，为研究鸡AMHR2基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、细胞系与载体 本试验使用的DH5α、JM109感受态细胞基于Inoue方法制备[14]；HEK293T细胞、鸡DF-1细胞、敲除载体原质粒pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9和SSA-RPG双荧光报告载体原质粒pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200bp repeat.Puro-T2A-GFP保存于西北农林科技大学动物科技学院动物基因组编辑实验室。

1.1.2 试剂 琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒(Omega)，T4DNA连接酶与限制性内切酶(BsaI、BamH I和NotI)(NEB)，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(上海翊圣生物科技有限公司)，Lipofectamine3000转染试剂(Life Technologies)，Puromycin(Sigma-Aldrich)，pMD19-T载体(TaKaRa)，DMEM基础培养基(Gibco)，Opti-MEM培养基(Invitrigen)。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡AMHR2基因靶位点的选择 通过crispr.mit.edu:807网站对鸡AMHR2基因的特异CDs区序列进行CRISPR/Cas9靶位点预测，根据PAM和得分，选择位于第二外显子上相距14 bp、GC含量分别为80%和75%(sg2-1: CTTCAGGCTGCGGCGCGCGCTGG；sg2-4: GTGGTGCGACTCCACGCCGCCGG)的成对靶位点。

1.2.2 鸡AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建 通过Annealing PCR拟合得到靶位点序列，引物序列见表1。对pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9原载体(图1)和靶位点拟合产物用BsaI限制性内切酶进行单酶双切，37 ℃酶切4 h后进行胶回收纯化。将纯化的载体骨架与AMHR2靶位点通过T4连接酶在16℃下过夜连接。利用DH5α感受态细胞对连接产物进行转化，在有Amp抗性的LB培养板上37 ℃培养10 h左右。用无菌10 μL透明吸头挑取成型菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的菌落加入2 mL有Amp抗性的液体LB培养基中，37 ℃恒温摇床中震荡培养10～16 h。通过质粒小提试剂盒提取菌液质粒，最终获得鸡AMHR2基因的敲除载体。提取的质粒送至生工公司进行测序分析，鉴定正确后保存于-20 ℃。

1.2.3 SSA-RPG双荧光报告载体的构建 利用Primer Premier 6根据靶位点在鸡基因组上的位置设计引物(见表1)，以鸡的基因组DNA为模板扩增出包含成对靶位点的DNA序列。用NotI和BamH I分别对pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP原载体(图2)和AMHR2靶位点扩增产物进行双位点酶切，37 ℃酶切4 h后分别进行胶回收和溶液回收纯化。后续载体构建及鉴定过程同1.2.2。

表1 载体构建引物序列Table 1 Primers for vector construction

注：小写字母.BsaI、NotI和BamH I酶切位点；.终止密码子。

Note: Lowercase letters.BsaI,NotI &BamH I Restriction enzyme site;.Termination codon.

1.2.4 HEK293T细胞与鸡DF-1细胞的转染 本试验中HEK293T细胞采用DMEM基础培养基，添加10% FBS和1% Anti-Anti，在常规细胞培养环境下培养。转染前将HEK293T细胞传代至24孔板中，接种密度为每孔1×105个细胞，当细胞密度达到70%左右时参照Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书对细胞进行转染，每个处理设置3个重复。转染后在常规细胞培养环境下培养48 h，通过荧光倒置显微镜观察细胞荧光。

DF-1细胞的培养条件与HEK293T细胞相同，转染前将DF-1细胞传代至12孔板中，当细胞密度达到70%～90%时用Lipofectamine3000转染试剂进行转染，每个处理设置3个重复。转染后在常规细胞培养环境下培养48 h，通过荧光倒置显微镜观察细胞荧光后，将培养基置换为含有3 μg/mL Puromycin的药物筛选培养基，对敲除AMHR2基因的阳性细胞进行筛选，每天更换Puromycin药物筛选培养基并观察细胞状态，药物筛选140 h后阴性对照组DF-1细胞几乎全部死亡而试验组有少部分阳性细胞存活。将培养基统一更换为不含Puromycin的培养基，当DF-1细胞增殖到密度接近90%时收集细胞。利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒分别提取试验组的DF-1细胞基因组DNA，用Nanodrop2000微量检测仪测定浓度后于-20 ℃保存。

1.2.5 TA克隆检测 以试验组的DF-1细胞基因组DNA(见1.2.4)为模板，用AMHR2e2-TA-F/R引物(见表1)扩增第二外显子上包含靶位点的564 bp片段，PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化。

根据pMDTM19-T Vector Cloning Kit说明书将纯化的PCR产物整合到pMD19-T载体上。用JM109感受态细胞进行转化，37 ℃培养12 h后，挑20个单克隆利用引物AMHR2e2-TA-F/R与pMD19-T载体上的通用引物M13-R进行菌落PCR，初步鉴定为阳性后用含有2 mL Amp抗性的LB液体培养基进行摇菌培养至浑浊，送至公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 鸡AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

通过网站预测得到位于第二外显子上的成对鸡AMHR2基因CRISPR/Cas9靶位点，相距14 bp，将退火拟合得到的2个靶位点片段分别与pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9骨架连接，构建出成对的鸡AMHR2基因敲除表达载体。测序结果见图3，表明2个鸡AMHR2基因敲除表达载体均构建成功。

2.2 SSA-RPG双荧光报告载体的构建

以pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP为骨架构建与AMHR2敲除表达载体对应的SSA-RPG双荧光报告载体。测序结果见图4，表明SSA-RPG双荧光报告载体构建成功。

2.3 报告载体水平AMHR2基因敲除表达载体的工作效率

转染后48 h的HEK293T细胞荧光观察结果如图5，红光代表转染效率，绿光代表敲除载体工作效率。阴性对照组由于敲除载体只表达Cas9而没有引导Cas9蛋白识别靶位点的sgRNA，因此无法进行靶位点的特异切割，被转染的细胞只有红色荧光而没有绿色荧光。3个试验组相比，试验组A的

转染效率和靶位点敲除效率均高于试验组B和试验组C。因此，从报告载体水平来看成对靶位点打靶的AMHR2基因敲除效率要高于单一靶位点打靶的敲除效率，将成对敲除载体与其对应的双荧光报告载体共转染可以最大限度提高转染效率和敲除载体的工作效率。

为了确定构建的敲除载体是否可以在鸡的基因组上进行打靶，本试验利用鸡AMHR2基因敲除表达系统对鸡DF-1细胞进行转染。由于在HEK293T细胞上的转染试验结果显示成对敲除载体与对应的报告载体共转染可以最大限度提高转染和敲除效率，本试验设置了共转染成对敲除载体和报告载体的试验组与共转染野生型原载体和报告载体的阴性对照组。转染后48 h与Puromycin药物筛选后140 h时对DF-1细胞观察结果如图6：试验组被转染的DF-1细胞有绿色荧光，且经过140 h的药物筛选后，阴性对照组的细胞几乎全部死亡，试验组的转染效率和敲除效率均有提高。

2.4 TA克隆检测基因组水平敲除载体的工作效率

3 讨 论

基因编辑是研究基因功能的重要方法之一，CRISPR/Cas9技术相较于ZFN和TALEN技术具有简单高效的特点，自发现以来在哺乳动物上有广泛应用[15-17]。CRISPR/Cas9技术在鸡中也有成功应用但仍处于初步阶段。2015年，Véron[12]对鸡胚的PAX7基因进行了敲除，首次实现了在鸡基因组上的编辑应用。然而，CRISPR/Cas9在鸡细胞中的应用存在着靶位点突变效率低的问题[18]。Cas9核酸酶对靶位点的特异切割是基于sgRNA能够准确识别目的基因的靶位点，但由于生物体的基因组极为复杂，sgRNA可能会与非靶位点进行错配，导致脱靶效应[19]。因此CRISPR/Cas9系统的靶位点的设计非常重要，有研究表明sgRNA的GC含量越高，对靶位点的切割效率越高[20]。为了利用CRISPR/Cas9技术对鸡的AMHR2基因进行特异敲除，首先应构建高效特异的Cas9敲除表达载体。不同于之前研究中对单一靶位点进行打靶的敲除系统，本研究通过crispr.mit.edu:807网站设计了位于鸡AMHR2基因第二外显子上的成对sgRNA靶位点，以期提高对AMHR2基因的打靶效率。

图7 菌落PCR鉴定阳性TA克隆
1～20. PRC产物；M.DNA Marker DL2000;图片中间的虚线表示图片经裁剪后拼接
Fig.7 Colony PCR identified Positive TA clones
1～20. Products of PRC；M.DNA Marker DL2000;The dotted lines between lanes represent cropped images

除了选择合适的靶位点以外，通过Puromycin药物筛选的方式也可以大大提高经过编辑的阳性细胞率[21]。本实验室于2016年利用自己构建的SSA-RPG双荧光报告载体系统与stCRISPR/Cas9系统在鸡DF-1细胞上实现了PPAR、ATP5E和OVA基因的成功敲除，经过Puromycin筛选后基因编辑的阳性细胞率可达95%[13]。双荧光报告载体的工作原理如图9所示[22]：由于靶位点的插入，Puro基因被打断，CAG启动子无法启动Puro基因以及通过T2A剪切肽与其融合表达的eGFP基因，报告载体转染细胞后只有由CMV启动子启动的DsRed基因表达，此时被转染的细胞发出红色荧光而没有绿色荧光。当CRISPR/Cas9敲除载体工作后，对靶位点进行切割敲除，靶位点两端的200 bp重复序列利用SSA机制对DSB进行修复，使Puro基因以及通过T2A剪切肽与其融合表达的eGFP基因能够重新表达，此时可以观察到细胞既有红色荧光也有绿色荧光。因此红色荧光即代表细胞被转染的效率，绿色荧光代表成功敲除靶位点的效率，成功被敲除靶位点的细胞具有Puro抗性，可利用Puromycin筛选出阳性细胞。

本研究首先在报告载体水平上比较了单一靶位点敲除系统和成对靶位点敲除系统的工作效率，AMHR2基因敲除系统被分为3个试验组和1个阴性对照组分别对HEK293T进行转染。结果表明，成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统。为了更准确地检测CRISPR/Cas9敲除系统在鸡的基因组水平上对AMHR2基因的敲除效率，后续试验采用成对鸡AMHR2基因敲除表达载体和对应SSA-RPG报告载体对DF-1细胞进行共转染，转染48 h后添加Puromycin进行药物筛选富集阳性细胞并提取基因组DNA。为了进一步检测CRISPR/Cas9敲除系统的工作效率，本研究进行了TA克隆并挑取阳性菌落进行测序分析。测序结果表明，DF-1细胞基因组中AMHR2基因的突变率为60.0%，基因突变类型为碱基缺失，表明CRISPR/Cas9系统能够成功对鸡基因组上的AMHR2基因进行特异敲除，但工作效率不高仍需进行试验改进。

4 结 论

本研究构建了靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统，在鸡DF-1细胞的基因组上对AMHR2基因进行了成功敲除(约60%)，为鸡AMHR2基因的功能研究奠定了基础。