陈福艳 覃雅 欧阳贤华 陈福彩 梁万文 雷爱莹 黎建斌

摘 要：为了筛选无乳链球菌敏感药物，对9种常用渔药抗生素进行了药物敏感试验，采用微量肉汤稀释法进行测定，通过加入阿尔玛蓝指示剂和革兰氏染色显微镜观察，得出各抗菌药物的最低抑菌浓度依次为：恩诺沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.2 μg/mL，诺氟沙星0.9 μg/mL，强力霉素0.9 μg/mL，庆大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。结果表明，恩诺沙星和氟苯尼考对无乳链球菌最敏感，杀菌力最强;在试验过程中，阿尔玛蓝指示剂有助于抑菌结果的判断。

关键词：罗非鱼;无乳链球菌;药敏试验

罗非鱼（Oreochromis spp.）种类繁多，养殖较多的品种有吉富罗非鱼 （Oreochromis niloticus）、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. aureus）、红罗非鱼（Oreochromis mossambi-cus×O. niloticus）等品种[1]。罗非鱼具有生长快，食性杂，无肌间刺，产量高等优点[2]，广受养殖户和消费者的喜爱。随着生活水平的提高，人们更加注重健康生活和环境保护，要求“少污染，多健康和高效益”，因此对水产养殖工作者提出了更高的要求。水产养殖业大规模发展过程中，常受细菌疾病的侵害，其中由无乳链球菌引起的细菌病在每年的7-10月份爆发频繁。两广地区罗非鱼养殖场曾出现大批罗非鱼发病、死亡，给罗非鱼养殖业带来了不可估量的经济损失[3]。部分罗非鱼感染链球菌后会出现鱼眼球混白或者突出，体表发黑，肝、肾和脾等组织败血等症状，严重影响罗非鱼生长、存活率以及经济效益[4]。

临床上常规应对罗非鱼细菌病防疫和治疗措施主要是施加相应的抗生素，但近年来抗生素类药物使用不规范，引起抗药性和耐药性等问题[5]，病害治疗效果不佳，常发生持续性死亡，且难于根除;罗非鱼患病后，饲料投喂量下降，影响鱼的生长速度。因此对无乳链球菌病的防治工作迫在眉睫，有必要开展该菌的药敏试验，筛选出敏感的防治药物，为临床罗非鱼链球菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 床菌株为本实验室分离鉴定和保种的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，NO：180623）.

1.1.2 实验药物 试验筛选了9种常用渔用抗生素：林可霉素、阿莫西林、磺胺嘧啶、庆大霉素、诺氟沙星（已禁用）、新霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素;这些药物均为北京鑫洋水产科技有限公司赠送的原粉。

1.1.3 实验仪器 电子天平、96孔培养板、移液器、恒温摇床、50 mL离心管、酒精灯、分光光度计、恒温培养箱、JA5003N电子天平、高压蒸汽灭菌锅、优普超纯水器。

1.1.4 培养基 TSA培养基：胰蛋白胨 17 g，大豆胨 3 g，葡萄糖 2.5 g，NaCl 5 g，K2PO4 2.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.0～7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 按参考文献[6]的方法并根据预备实验配制9种抗菌药物的母液，他们依次为：林可霉素200 μg/mL、阿莫西林200 μg/mL、磺胺嘧啶450 μg/mL、庆大霉素100 μg/mL、新霉素50 μg/mL、诺氟沙星10 μg/mL、恩诺沙星2 μg/mL、氟苯尼考2 μg/mL、强力霉素2 μg/mL。用超纯水配制母液浓度，完全溶解、搅拌均匀，用022 μm过滤器除杂除菌，置-20 ℃保存备用。

甘油20 mL，0.1%阿尔玛蓝（刃天青）溶液20 mL，配置完成后用0.22 μm过滤器过滤除菌，放置4 ℃冰箱保存。

配制TSA培养基1 L，121 ℃高压灭菌，冷却，放置4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 肉汤稀释法

1.2.2.1 接种物的制备 将实验菌株（NO：180623）活化后进行液体培养，接种完成后放到37 ℃摇床（100 r/min） 培养12 h，培養后的菌液进行稀释，用分光光度计测量菌液浓度，将菌液浓度稀释成1×105 cfu/mL，现配现用。

1.2.2.2 抗菌药物浓度稀释 参考预备实验结果，确定最大浓度，将已灭菌的96孔培养板放置在超净工作台上进行无菌操作，按2/3倍数浓度梯度稀释后，得出11个浓度梯度组。

1.2.2.3 菌液接种 在96微孔板上每一行的第1孔中加入相应稀释一定浓度后的抗菌药物300 μL，用8道移液枪吸取肉汤培养基100 μL加入第2～12孔，将第1孔药液吹打均匀后吸取200 μL至第2孔，接着将第2孔药液吹打均匀后吸取200 μL药液至第3孔，以此类推直至第11孔时，吸除200 μL;第12孔作为空白对照，加入100 μL稀释好的菌液（1×105 cfu/mL）。为了更好地观察实验结果，加入10 μL蓝色阿尔玛蓝和10 μL甘油。每种药物4个平行。加样完成后，密封96微孔板，放置于37 ℃培养箱中培养12 h，连续观察指示剂变化[7]。

1.2.2.4 结果判断方法 结果判断采用肉眼观察与显微观察相结合。肉眼观察即根据颜色变化和浑浊度来判断是否生长细菌。当空白对照孔（第12孔）为红色时，即为有效检测，反之则无效，需重新实验。以96微孔板上蓝色的最低药物浓度判断为最低抑菌浓度（MIC），红色孔判断为不能杀死或抑制细菌生长浓度。显微观察即取各浓度组里的培养液进行革兰氏染色与油镜显微观察，以不生长细菌的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

2 实验结果

通过肉眼观察实验结果，即根据阿尔玛蓝指示剂在12 h的培养时间里颜色从青蓝，到红紫，最后粉红的这个变化过程，判断9种抗菌药物对无乳链球菌的影响程度，得到各种药物最小抑菌浓度为：恩诺沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.3 μg/mL，诺氟沙星0.9 μg/mL，强力霉素0.9 μg/mL，庆大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。

进一步验证实验结果，采用革兰氏染色后油镜显微观察，9种药物的实验结果与肉眼观察结果一致。可见两种最小抑菌浓度判断结果一致，阿尔玛蓝可作为药敏结果判断的指示剂。

3 讨论

鲁晶娣等[8]采用纸片药敏试验方法对来源于柳州不同地区的20株无乳链球菌进行药敏试验，结果表明不同来源菌株对同一种药物敏感性存在差异。而本试验只选用一株无乳链球菌进行药敏试验，尽管本实验进行四组平行，该菌株的最低抑菌浓度可能与不同来源的无乳链球菌存在差异，因此本试验结果仅供参考，具体用药还需了解当地池塘的用药史，尽量错开用药，同时严格遵守药物使用规范。研究还表明20株无乳链球菌中对同种药物敏感性有差异，结果如表2所示，这些抗菌类药物敏感性分析可为养殖者提供参考。

梁志凌等[9]采用琼脂扩散法的牛津杯法研究82种中草药对无乳链球菌的抑菌活性。结果表明，其中抑菌能力最强的七种中草药及其抑菌圈分别为：黄连（40 mm±2.1 mm） 、五倍子 （36 mm±1.9 mm）、红藤（27 mm±0.9 mm） 、大蒜（27 mm±0.8 mm） 、北五味子（26 mm±1.1 mm） 、夏枯草（25 mm±1.6 mm） 、艾叶（25 mm±1.4 mm），这些结果为防治无乳链球菌筛选中草药提供参考。

无乳链球菌在病害防治过程中，往往采用抗生素和中草药配伍的防治方法，抗生素达到快速杀灭病菌，中草药杀菌能力相对较弱但具有提高身体免疫力的作用，因此两者相结合是当前常用的治疗方法。但在抗生素与中草药结合用药时要注意药物之间的协同作用与拮抗作用，具体有待进一步研究。

参考文献：

[1]

王巧煌.福建红罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及其分子特征[J].大连海洋大学学报，2019，34（1）：64-69.

[2] 壮林.广西罗非鱼链球菌的分离鉴定、药敏试验与病理学研究[D].南京农业大学，2012.

[3] 李旻，王凯，陈明，等.罗非鱼无乳链球菌的分离纯化及鉴定[J].大众科技，2017，19（11）：85-89.

[4] 程世亮，刘新风，郑文，等.鱼类无乳链球菌病[J].动物醫学进展，2016，37（2）：105-109.

[5] 邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.广西罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定[J].广西农业科学，2010，41（05） ： 495-498.

[6] 陈福艳，欧阳贤华，黄彩林，等.一种创伤弧菌快速药敏试剂盒的研发[J].江西水产科技，2016（05）：10-14.

[7] 熊礼宽，周亚红，付丽华，等.分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究[J].动物医学进展，2004，25（5）：78-81.

[8] 鲁晶娣，韦盘秋，曾令杰，等.柳州地区罗非鱼无乳链球菌与海豚链球菌分离株药敏性分析[J].广西畜牧兽医，2019，35（2）：57-60.

[9] 梁志凌 ，马艳平 ，马江耀，等 .82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究[J].广东农业科学 ，2016，43（10）：128—133.

（收稿日期：2020-04-21）