温昱晨，郝宇，解琳，张东向，莫继先，刘本松，金忠民

（1. 齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 海南地质综合勘察设计院，海南 海口 570100）

近年来我国工业发展迅速，由于“三废”治理不彻底和过量使用化肥农药等原因，导致我国土壤重金属污染日趋严重，影响植物的正常生长发育[1]．铅镉是植物生长发育过程中的非必需元素，对自然界有较大危害，可通过食物链进入人体，土壤中铅、镉、汞、砷、铬合称为“五毒元素”[2]．在铅镉胁迫下，植物代谢会产生活性氧（ROS），过多积累会对植物造成伤害[3]，而植物体内的抗氧化酶主要包含超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等，并且能够清除体内的活性氧（ROS）[4]．镉与叶绿体中蛋白质的巯基相结合，可以破坏叶绿体的结构和功能，进一步使叶绿素（CHL）降解，对植物光合作用产生巨大影响[5]．

黑麦草（Lolium perenneL）是多年生优良牧草，细弱根状茎，适宜生长在温和湿润环境，在10～27 ℃之间都能较好生长，其生长周期短，生物量大，适应性强[6]，具有富集重金属能力，单独种植时具有较大的富集系数（0.75）[7]．

乙二胺二琥珀酸（EDDS）是一种可降解、配合能力强且容易与重金属相结合的螯合剂[8]．EDDS可以与土壤中的镉结合，酸可提取态镉含量随EDDS浓度的增加而增加，能有效活化镉[9]．合适的螯合剂经螯合作用可以改变土壤重金属活度，从而达到重金属吸收积累到植物地上部分的目的[10]．研究表明，螯合剂具有诱导植物提取土壤中重金属的能力，其能力与植物品种、土壤性质、重金属本身属性及螯合剂施加方式有关[11]，选择适宜的EDDS浓度对修复铅镉污染的农用地具有重要意义．

研究EDDS对铅镉复合胁迫下黑麦草SOD，POD，CAT，CHL的影响，为针对不同程度铅镉污染的土壤选用相适应浓度的EDDS提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑麦草种子（北京金农丰源种子公司）；实验用土壤（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物园）．

1.2 实验方法

使用硫酸镉和硝酸铅配制不同质量浓度得铅镉混合溶液处理土壤，设置铅镉质量浓度梯度为0，0；150，15；300，30；600，60；1200，120 mg/kg，分别记为T0，T1，T2，T3，T4．将土壤放置6 个月，待用，通过盆栽实验种植，精选饱满的黑麦草种子，先用水浸泡12 h后再用70%乙醇消毒，晾干后播种，室温培养．待生长30 d后，分别向各处理组的根部注射不同浓度的EDDS，设置EDDS浓度梯度为0，0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg，EDDS注射量为每盆20 mL，每组处理3个平行，培养7 d后，选取长势一致的黑麦草幼苗进行各项生理指标的测定．

1.3 测定指标

1.3.1 氮蓝四唑法测定SOD活性[12]SOD活性其中：ACK为对照管OD值；AE为测定管OD值；VT为酶提取液总体积（mL）；Vt为测定时样品用量体积（mL）；m为样品鲜质量（g）．

1.3.2 愈创木酚法测定POD活性[13]POD活性其中：ΔA470为反应时间内吸光值的改变值；VT为提取酶液总体积（mL）；VS为测定时吸取酶液用的体积（mL）；m为样品鲜质量（g）；t为反应时间（min）；0.01为ΔA470为每下降0.01为一个酶活单位．

1.3.3 紫外分光光度法测定CAT活性[14]CAT活性其中：ΔA为反应时间内吸光值的改变；V为提取酶液总体积（mL）；V为测定时240TS吸取酶液的体积（mL）；m为样品鲜质量（g）；t为反应时间（min）；0.1为ΔA240每下降0.1为一个酶活单位；A0为对照管为加入煮沸酶液的吸光值；A1，A2为测定吸光值．

1.3.4 分光光度计法测定 CHL含量[15]CHL质量分数其中：c=ca+cb，ca=13.95A665-6.88A649，cb=24.96A649-7.32A665，c为色素的质量浓度（mg/L），ca和cb分别为叶绿素 a和叶绿素b的质量浓度（mg/L）；V为提取液总体积（mL）；n为稀释倍数；m为样品鲜质量（g）．

1.4 数据处理及分析

采用SPSS 20.0软件进行显著性分析，采用Prism软件进行制图．

2 结果与分析

2.1 EDDS对铅镉复合胁迫下黑麦草幼苗SOD活性的影响

SOD具有清除植物体内ROS的功能，主要机制是清除超氧阴离子自由基（O2-）[16]．不同浓度的EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗SOD活性的影响见图1．由图1可见，T0组中不同EDDS浓度下黑麦草幼苗SOD活性差异不显著，说明在无铅镉胁迫下EDDS对黑麦草幼苗SOD活性的影响较小．T1组中，随着EDDS浓度的增加，叶片SOD的活性增加，分别比T0组低59.19%，56.99%，52.49%，46.14%，33.73%，说明土壤中的铅镉影响黑麦草幼苗SOD活性．T2，T3，T4组内的SOD活性也逐渐增加，说明EDDS可以增加黑麦草幼苗SOD活性，对铅镉复合胁迫下的黑麦草起到缓解作用．在未加EDDS的条件下，随着铅镉复合质量浓度的增加，黑麦草SOD活性呈先增加后减少的趋势，说明黑麦草自身具有一定抵抗铅镉胁迫的能力．在EDDS浓度为2.4 mmol/kg时，随铅镉复合质量浓度的增加，黑麦草幼苗SOD活性呈先增加后减少的趋势，说明并不是EDDS浓度越高对铅镉胁迫下黑麦草幼苗的缓解效果越好，应根据不同的铅镉污染程度选择不同的EDDS浓度．在土壤铅镉质量浓度为600，60 mg/kg时，施加浓度为2.4 mmol/kg的EDDS使黑麦草SOD活性达到最大，说明在此土壤污染程度下施加EDDS浓度为2.4 mmol/kg时对黑麦草的缓解效果最好．在T3组中，施加EDDS浓度为0.3，0.6，1.2 mmol/kg时，SOD含量差异不显著（p＞0.05），EDDS浓度为2.4 mmol/kg时SOD含量最高，与不同EDDS浓度下SOD含量差异显著（p＜0.05）．当施加浓度为2.4 mmol/kg的EDDS时，铅镉质量浓度为1200，120 mg/kg下的SOD活性比铅镉质量浓度为600，60 mg/kg下的SOD活性减少了27.92%，说明土壤中铅镉含量过高时，EDDS对黑麦草幼苗的缓解能力减弱．对照与T0组中EDDS浓度为0.3，0.6，1.2 mmol/kg的SOD含量相比，差异不显著（p＞0.05），对照与在其它铅镉复合质量浓度和EDDS浓度下的SOD含量相比，差异显著（p＜0.05）．

图1 不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗SOD活性的影响

2.2 EDDS对铅镉复合胁迫下黑麦草幼苗POD活性的影响

POD在植物组织中大量存在，活性较高，与植物的光合作用、呼吸作用以及生长素的氧化密切相关[17]．不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗POD活性的影响见图2．由图2可见，T1组随着EDDS浓度的增加，黑麦草幼苗POD的活性增加，分别比T0组低73.98%，67.09%，58.01%，44.88%，35.94%，说明铅镉对黑麦草幼苗POD活性有影响，EDDS能缓解铅镉对黑麦草幼苗的伤害．在T2组中，EDDS浓度为0，0.3，0.6 mmol/kg时，植物地上部分POD含量差异不显著（p＞0.05），EDDS浓度为1.2，2.4 mmol/kg时，叶片POD含量差异不显著（p＞0.05）．在T3组中EDDS浓度为2.4 mmol/kg时，黑麦草幼苗POD活性达到最大，与组内相比差异显著（p＜0.05），说明在土壤铅镉质量浓度为 600，60 mg/kg下，施加浓度为2.4 mmol/kg的EDDS对黑麦草幼苗的缓解效果最好．在不加EDDS下的黑麦草幼苗，随复合铅镉质量浓度的增加，黑麦草幼苗POD活性呈先增加后减少的趋势，说明黑麦草幼苗能适应低质量浓度的铅镉含量，可自身调节铅镉胁迫带来的危害．对照与T0组中EDDS浓度为0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的POD含量相比，差异不显著（p＞0.05），对照与其它铅镉复合质量浓度和EDDS浓度下的POD含量相比，差异显著（p＜0.05）．

图2 不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗POD活性的影响

2.3 EDDS对铅镉复合胁迫下黑麦草幼苗CAT活性的影响

CAT与SOD，POD相类似，在植物组织中的含量也很高，主要机制是将过氧化氢分解为氧气和水，使植物机体免受毒害[18]．不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗CAT活性的影响见图3．由图3可见，T0组中不同浓度EDDS下黑麦草幼苗CAT的活性差异不显著（p＞0.05），说明在无铅镉胁迫下EDDS对黑麦草幼苗CAT的活性影响较小．在T1组内，随着EDDS浓度的增加，黑麦草CAT活性呈先增加后减少的趋势，处理组（T1）比T0分别低61.5%，54.83%，49.3%，35.64%，47.57%，在T1组内，虽然EDDS浓度为0.6，1.2，2.4 mmol/kg时植物叶片CAT含量差异不显著（p＞0.05），但EDDS为1.2 mmol/kg时植物叶片CAT含量稍高，说明铅镉胁迫明显改变黑麦草幼苗CAT活性，EDDS浓度为1.2 mmol/kg时能较好地缓解铅镉胁迫下黑麦草幼苗的伤害．在不同铅镉复合质量浓度下，随EDDS浓度的增加，黑麦草幼苗CAT的活性均呈先增加后减少的趋势，说明适当的EDDS浓度能减缓铅镉给黑麦草幼苗带来的伤害，而过高浓度的EDDS会加重伤害．在铅镉质量浓度为600，60 mg/kg，施加1.2，2.4 mmol/kg的EDDS时，黑麦草叶片CAT含量差异不显著（p＞0.05），但EDDS为1.2 mmol/kg时CAT含量较高，说明1.2 mmol/kg的EDDS对600，60 mg/kg铅镉下的黑麦草幼苗缓解效果较好．对照与T0组中EDDS浓度为0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的CAT含量相比，差异不显著（p＞0.05），对照与其它铅镉复合质量浓度和EDDS浓度下的CAT含量相比，差异显著（p＜0.05）．

图3 不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗CAT活性的影响

2.4 EDDS对铅镉复合胁迫下黑麦草幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素直接参与光能的吸收、传递和转化等过程，在光合过程中起着至关重要的作用[19]．不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗叶绿素的影响见图4．由图4可见，T0组中不同浓度EDDS对黑麦草叶片叶绿素含量影响差异不显著（p＞0.05）．T1组比T0组分别低31.07%，38.09%，43.82%，47.81%，50.00%，说明铅镉影响黑麦草幼苗叶绿素的含量．从T1，T2，T3组可以看出，随着EDDS浓度的增加，黑麦草幼苗叶绿素的含量均呈逐渐减少的趋势，说明EDDS能使铅镉胁迫下黑麦草幼苗失绿，影响光合作用，进而影响植物生长发育．在T1组中，黑麦草叶片叶绿素含量在EDDS浓度为0，2.4 mmol/kg两者比较下差异显著（p＜0.05），而EDDS浓度在相邻梯度之间时，叶绿素含量差异不显著（p＞0.05）．在T2，T3组内也存在与T1组相同的情况．在未加EDDS的条件下，随铅镉复合质量浓度的增加黑麦草幼苗叶绿素的含量减少，说明越高质量浓度的铅镉对黑麦草幼苗叶绿素含量的影响越大．在T4组内，叶绿素含量呈先减少后增加的趋势，在EDDS浓度为2.4 mmol/kg时叶绿素含量最高，说明此时的EDDS浓度对铅镉质量浓度为1200，120 mg/kg下的黑麦草幼苗缓解效果最好．对照与T0组中EDDS浓度为0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的叶绿素含量相比，差异不显著（p＞0.05），对照与其它铅镉复合质量浓度和 EDDS浓度下的叶绿素含量相比，差异显著（p＜0.05）．

图4 不同浓度EDDS对不同铅镉质量浓度处理下黑麦草幼苗叶绿素的影响

3 讨论

在农业种植方面，农药、化肥及塑料薄膜的大量使用会造成农用地铅镉污染．铅镉在土壤中具有极强的积累性、不可降解性，因此农业土壤中铅镉的过量积累对粮食安全和人类健康存在巨大风险[20]．有研究表明，在镉胁迫下的黑麦草，通过添加外源EDDS可使其体内SOD，POD，CAT活性显著增加[21]，这与本实验结果相似．分别从不同复合铅镉质量浓度处理来看，随EDDS浓度的增加，SOD，POD的活性均呈逐渐增加的趋势，在EDDS浓度为2.4 mmol/kg时，SOD和POD活性达到了最大，故在EDDS浓度为2.4 mmol/kg时，能较好地缓解铅镉对植物的危害．有研究发现在镉质量浓度为40 mg/kg的胁迫下，随EDDS浓度的增加，叶片中CAT活性呈先升后降的趋势，其活性均显著高于对照[22]．本实验证实了这一点，在不同复合铅镉质量浓度下，随 EDDS浓度的增加，黑麦草 CAT的活性均呈先增加后减少的趋势．在铅镉质量浓度为600，60 mg/kg和EDDS浓度为1.2 mmol/kg时，黑麦草幼苗CAT活性达到了最高，此时EDDS是缓解铅镉质量浓度为600，60 mg/kg下黑麦草幼苗伤害的最适浓度．叶绿素是植物细胞的重要色素，其含量减少，光合作用强度下降，植物体内有机物合成减少，导致植物死亡[23]．实验结果表明，在T1，T2，T3组中，随EDDS浓度的增加，叶绿素含量呈逐渐减少的趋势，EDDS浓度均在2.4 mmol/kg时叶绿素含量最少．这与前人研究结果相似，EDDS能促进铅镉由植物根部向地上的转运，使高羊茅和红三叶2种植物叶片的叶绿素含量下降[24]．在T4组中，施加0.6 mmol/kg的EDDS使叶绿素含量最少，可能与螯合程度有关，可进一步探究植物地上部分铅镉含量加以分析．综上所述，当土壤铅质量浓度在150～600 mg/kg，镉质量浓度在15～60 mg/kg之间时施加1.2～2.4 mmol/kg的EDDS能较好地缓解铅镉带来的危害．

刘金[25]等研究发现，EDDS在浓度为1.5～3 mmol/kg时，促进苎麻对镉的富集．本实验只做到在不同复合铅镉质量浓度胁迫下，通过施加不同浓度的EDDS选出对黑麦草幼苗缓解伤害效果最好的浓度，为不同铅镉污染程度的土壤选用相适应的EDDS浓度提供理论依据，后续可以研究EDDS对铅镉胁迫下黑麦草幼苗的富集，为植物修复奠定基础．如果通过EDDS进行植物修复，富集铅镉后的植物要处理得当，进行定期回收，否则容易造成二次污染，后面的研究应寻找处理植物的最佳办法．在治理农业土壤时，针对不同程度的污染区，选用适当浓度EDDS，才能有效治理受污染的土壤，避免对土壤的二次污染和肥力降低．

4 结论

（1）黑麦草对铅镉有一定的抗性，能通过自身调节过氧化酶的活性．

（2）在铅镉胁迫下，添加适当浓度的 EDDS有利于缓解黑麦草幼苗的伤害，过高容易损害植物，过低则缓解伤害的效果不佳．

（3）根据不同程度铅镉污染的土壤应选择相适应的EDDS浓度，才能有效地缓解铅镉带来的危害．