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连作与轮作对温室土壤中真菌多样性的影响

2020-06-21高磊

南方农业·下旬 2020年3期
关键词:多样性真菌

摘 要 以不同连(轮)作年限种植白肉灵芝的温室土壤为实验材料,研究不同连(轮)作年限土壤真菌多样性的变化趋势。通过高通量测序技术并结合相关生物信息学方法,分析土壤中真菌ITS1+ITS2区域的丰富度、多样性指数以及群落结构。结果表明,连作或轮作后均能够提高微生物群落多样性,子囊菌门、担子菌门及接合菌门为优势真菌,担子菌门的比例随连作年限的增加而逐渐增加,轮作后丰度降低。

关键词 白肉灵芝;真菌;多样性

中图分类号:S154.3 文献标志码:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.093

土壤中的微生物主要通过吸收和转化的途径影响养分的利用,而造成土壤营养水平低下及产品产量、质量下降的原因则可能是微生物种群发生了变化[1]。产品连作年限较久会造成土壤中微生物种群结构单一化,从而造成土壤质量直线下降,土壤pH发生变化甚至于造成产品产量大减或者绝收。而造成产品减产的原因则主要是真菌,如尖孢镰刀菌、疫霉属及炭疽菌属等致病真菌。基于此,从真菌数量、种类等方面,研究连作和轮作对土壤中真菌多样性的影响,为连作障碍提供理论依据[2-3]。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

试验于2019年3—8月在西藏自治区现代农业产业示范园区温室大棚进行。

1.2 试验材料

5个相邻的温室:1)多年未种植白肉灵芝;2)连作白肉灵芝2年;3)连作白肉灵芝2年后轮作种植羊肚菌;4)连作白肉灵芝3年后轮作种植蒜苗;5)连作白肉灵芝3年后换土。

试剂盒:E.Z.N.A.?Soil DNA Kit。

1.3 取样及保存

5个温室分别在白肉灵芝未种植及种植后分时间段采取土壤样品于-20℃冷冻保存。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤微生物基因组DNA的提取

称取0.5 g于-20 ℃保存的土壤样品,按试剂盒的试验步骤进行微生物总DNA的提取,DNA样品于-20 ℃保存待用。

1.4.2 试验流程

提取样品总DNA后,根据设计得到真菌ITS1+ITS2合成的引物,合并引物接头,进行PCR扩增。

PCR反应体系:含15 mmol·L-1 MgCl2的10×Buffer 10.0 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL,10 μmol·L-1引物各5.0 μL,5 U·μL-1Taq酶1.0 μL,DNA模板4.0 μL,灭菌去离子水73.0 μL,总体积100 μL。

PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 10 min。

文库建立:对产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库,建好的文库先进行文库质检,质检合格的文库用HiSeq PE250进行检测,由联川生物技术公司完成测序[4]。

1.4.3 数据处理

试验数据均采用Excel和SPSS软件進行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同连作年限土壤真菌OTU聚类分析

将所有样品的有效序列进行聚类,按照97%的序列相似度将这些序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units),得到每个Cluster的序列及其代表序列(即为OTU),用于统计每个OTU序列和丰度进行下游分析[5]。

由图1的Venn图可知,1号温室总OTUs为448,2号温室总OTUs为1 390,3号温室总OTUs为1 211,4号温室总OTUs为925,5号温室总OTUs为421;5个样品中共有的OTUs个数有143个,其中2号温室特有OTUs个数最多,达到240个(因5号温室置换土壤过程中导致数据异常,不再对其进行后续分析)。

2.2 不同连作年限土壤真菌Alpha多样性分析

Alpha多样性也称为生境内物种多样性[6],包括Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon和Simpson指数。利用Alpha多样性分析方法,对土壤样品中的OTUs总数和Chao1指数进行分析,可得出连作土壤中真菌的多样性变化及数值[7]。不同年限连(轮)作下土壤真菌Alpha多样性的结果如表1所示。

由表1可知,在白肉灵芝生长过程中,轮作及连作土壤中真菌的OTUs总数及Chao1指数均高于未种植灵芝温室;连作后轮作的品种对温室土壤真菌群落OTUs总数及Chao1指数有一定的影响。通过Alpha多样性分析可知,连作与轮作均能够提高微生物群落多样性。

2.3 不同连作年限土壤真菌群落门类组成物种分析

2.3.1 不同连作年限土壤真菌物种分类统计

根据物种丰度表,选取丰度最高的20个物种分类,进行相对丰度计算,获得相对丰度数据,绘制样品丰度柱状图,便于更直观地进行样品丰度比较[8-9]。图2和图3中横轴为样品名称,每个样品3个重复,纵轴代表门及属的相对丰度;不同颜色对应不同物种。由图2门级别柱状图可以看出各温室土壤中占比最高的真菌为子囊门(Ascomycota),其次分别为担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota);连作增加了担子菌门的相对丰度,轮作降低了担子菌门的相对丰度,却增加了接合菌门的相对丰度。由图3属级别柱状图可以看出2、3、4号温室中内生菌属(Phialocephala)含量较多,1号温室内生菌属含量较少;木霉属(Hypocrea)在各温室土壤中含量较高;烟色织孢霉属(Plectosphaerella)在2、4号温室含量较高,1、3号温室含量较少;透孢黑团壳属(Massarina)在2、3号温室含量较高,4号含量较少,1号温室没有;灵芝属(Ganoderma)除了1号温室没有外,在2、3、4均有存在。

3 结论

通过微生物测序技术得出白肉灵芝轮作和连作土壤样品中真菌的门、属类别及丰度,发现连作或轮作后均能够提高微生物群落多样性,子囊菌门、担子菌门及接合菌门为优势真菌,担子菌门的比例随连作年限的增加而逐渐增加,轮作后丰度降低,但接合菌门的相对丰度增大。但是仍有很大一部分类别真菌物种尚未鉴定出,尤其是属级别真菌,所以需要进行进一步的研究探讨和鉴定。

参考文献:

[1] 马琨,张丽,杜茜,等.马铃薯连作栽培对土壤微生物群落的影响[J].水土保持学报,2010,24(4):229-233.

[2] 周陈,李许,杨明开,等.冬小麦不同生育期土壤微生物及养分动态变化[J].西北农业学报,2008,17(3):113-116.

[3] 张重义,林文雄.药用植物的化感自毒作用与连作障碍[J].中国生态农业学报,2009,17(1):189-196.

[4] Bokulich N A,Subramanian S,Faith J J,et al.Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J].Nature methods,2013,10(1):57-59.

[5] Blaxter M,Mann J,Chapman T,et al.Defining operational taxonomic units using DNA barcode data[J].Philosophical transactions of the Royal Society of London,Series B,Biological Sciences,2005,360(1462):1935-1943.

[6] Sul W J,Cole J R,Jesus E C,et al.Bacterial community comparisons by taxonomy-supervised analysis independent of sequence alignment and clustering[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(38):14637-14642.

[7] Price M N,Dehal P S,Arkin A P.FastTree 2-Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments[J].Plos One,2010,5(5):e9490.

[8] Xiong W G,Wang Y L,Sun Y X,et al.Antibiotic-mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes[J].Microbiome,2018,6:34.

[9] Ren L L,Zhang R B,Rao J,et al.Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status[J].mSystems,2018,3(5):e00199-18.

(责任编辑:赵中正)

收稿日期:2020-01-15

基金項目:西藏白肉灵芝连(轮)作下土壤生物相关性研究(XZ2017ZRG-39);国家食用菌产业技术体系拉萨综合试验站课题(CARS-20-95);科技富民稳边专项-西藏特色食用菌高效栽培技术示范课题(XZ201901NA05)。

作者简介:高磊(1987—),男,甘肃白银人,硕士,助理研究员,从事食用菌培养等方向的研究。E-mail: 1173835491@qq.com。

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