曹丹 白腾飞 刘伟 汪飞 赵瑞华 高瑜 贺晓龙

摘 要 为探究镁离子、钙离子、锌离子、锰离子对北虫草液体发酵培养的影响，为北虫草工厂化生产提供技术依据，采用单因素和正交试验相结合的方法，以北虫草菌丝生物量为指标，综合其长势和培养基状态，选择出最优二价盐离子组合。试验结果表明，当镁离子为0.10 mg·mL-1，钙离子为0.02 mg·mL-1，锌离子为0.02 mg·mL-1，锰离子为0.02 mg·mL-1时北虫草的生物量达到最大，得到最优的二价盐离子组合。

关键词 北虫草;液体发酵;无机盐;二价盐离子

中图分类号：S567.3+5 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.070

北虫草又名北冬虫夏草、蛹草等，属真菌门，子囊菌亚门，子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属，是一大类重要的昆虫病原真菌[1]。蛹虫草是虫草属的模式种。研究证明，北虫草与冬虫夏草在药化和药理上十分相似，在功能食品、醫药和生物学技术方面有很好的食用价值[2]。近几年，由于市场需求日益扩大，野生的冬虫夏草已经不能满足现在的市场需要，所以与冬虫夏草具有相同作用的北虫草菌丝体被生产成各种保健营养品，但由于传统的固体栽培时间长，菌龄不统一等因素，不能满足现代生产的要求，所以液体发酵培养将成为北虫草人工栽培的重要方式。液体发酵栽培生长周期短，出菇整齐，有利于接种，有利于工厂化、规模化[3]。本次试验探究北虫草液体发酵过程中的二价矿物盐离子对菌种菌丝的影响，通过试验比较出适合北虫草生长的二价盐离子，为人工液体栽培北虫草提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

北虫草CY-1，由延安大学生命科学学院食用菌实验室提供。

1.1.2 供试药品

葡萄糖、琼脂、蛋白胨、磷酸二氢钾、维生素B1、维生素B6、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、硫酸钙等。

1.1.3 仪器设备

高压灭菌器、恒温培养箱、恒温摇床、UV-2600紫外可见分光光度计等试验室常用设备。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

PDA斜面培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL、pH自然。

液体培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、维生素B1 20 μg·L-1、维生素B6 10 μg·L-1、pH自然。

1.2.2 供试菌种的活化

取出保存在实验室超低温冰箱中的北虫草菌种，放在室温条件下，经过12 h的室温处理，使菌种活化，供试验使用。

1.2.3 供试菌种的扩大培养

取1.8 cm×20.0 cm的试管，装入10 mL配制好的PDA培养基，将试管放在高压灭菌锅中进行121 ℃、30 min的灭菌，灭菌完成后冷却制成斜面培养基。利用超净工作台，在严格控制的无菌条件下，铲取0.5 cm2菌块到新制作的PDA培养基上。将接种的PDA斜面试管放置在温度控制为21 ℃的恒温培养箱中恒温培养8～10 d，备用。

1.2.4 菌丝体液体培养

取150 mL的三角摇瓶，加入50 mL已经配制好的培养液，将配制好的培养液在高压灭菌锅中进行121 ℃、30 min灭菌，灭菌完成后制成液体培养基，静置1 d，检查灭菌情况。利用超净工作台，在无菌条件下向培养液中接入新培养的斜面菌种，接种量为0.5 cm2一块。将接好种的液体培养基在23 ℃静置24 h，然后置于23 ℃，180 r·min-1的恒温摇床中连续培养12 d。

1.3 单因素试验

1.3.1 镁离子对北虫草液体发酵的影响试验

分别用浓度为0.00 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1的镁离子替代原有液体培养基中的二价金属盐离子，设计5组重复试验。在培养的过程中测定液体培养基第8天的菌丝生物量，得出相关的具体数据，分析数据，同时观察菌丝的萌发时间、菌丝球的生长情况、发酵液状态等并做好记录，制作分析图表。

1.3.2 钙离子对北虫草液体发酵的影响试验

分别用浓度为0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的钙离子替代原有液体培养基中的二价金属盐离子，设计5组重复。在培养的过程中测定液体培养基第8天的菌丝生物量，得出相关的具体数据，分析数据，同时观察菌丝的萌发时间、菌丝球的生长情况、发酵液状态等并做好记录，制作分析图表。

1.3.3 锌离子对北虫草液体发酵的影响试验

分别用浓度为0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的锌离子替代原有液体培养基中的二价金属盐离子，设计5组重复。在培养的过程中测定液体培养基第8天的菌丝生物量，得出相关的具体数据，分析数据，同时观察菌丝的萌发时间、菌丝球的生长情况、发酵液状态等并做好记录，制作分析图表。

1.3.4 锰离子对北虫草液体发酵的影响试验

分别用浓度为0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1的锰离子替代原有液体培养基中的二价金属盐离子，设计5组重复。在培养的过程中测定培养基第8天的菌丝生物量，得出相关的具体数据，分析数据，同时观察菌丝的萌发时间、菌丝球的生长情况、发酵液状态等并做好记录，制作分析图表。

1.4 正交试验

根據单因素试验的试验结果，用4种不同二价金属阳离子的合适离子浓度进行正交试验。设计正交试验为4因素3水平表试验，正交试验设计表如表1所示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 镁离子对北虫草液体培养的影响

根据试验得到镁离子浓度在0.00 mg·mL-1、

0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1时北虫草菌丝的生长情况，通过数据分析、整理得到相关数据结果见表2。

根据表2的数据可以看出镁离子浓度对北虫草液体发酵生物量的影响：在离子浓度为0.10 mg·mL-1时，北虫草液体发酵培养得到的生物量最大;离子浓度在

0.00 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1时菌丝的萌发时间较短;离子浓度在0.10 mg·mL-1时菌球的生长状况最好，发酵液的相对性状也最好。综合以上数据分析可以得出，当镁离子浓度为0.10 mg·mL-1时单因素试验的结果最好，所以选择镁离子浓度为0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1做正交试验，进一步探究二价盐离子对北虫草液体发酵培养的影响。

2.1.2 钙离子对北虫草液体培养的影响

根据试验得到钙离子浓度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1时北虫草菌丝的生长情况，通过数据分析、整理得到相关数据结果见表3。

根据表3的数据可以得出钙离子浓度对北虫草液体发酵生物量的影响。在离子浓度为0.05 mg·mL-1时北虫草液体发酵培养得到的生物量最大;离子浓度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1时菌丝的萌发时间较短;离子浓度在0.05 mg·mL-1时菌球的生长状况最好;离子浓度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1时发酵液的相对性状最好。综合以上数据分析可以得出，当钙离子浓度为0.05 mg·mL-1时单因素试验的结果最好，所以选择钙离子浓度为0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交试验，进一步探究二价盐离子对北虫草液体发酵培养的影响。

2.1.3 锌离子对北虫草液体培养的影响

根据试验得到锌离子浓度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1时北虫草菌丝的生长情况，通过数据分析、整理得到相关数据结果见表4。

根据表4的数据可以看出锌离子浓度对北虫草液体发酵生物量的影响。在离子浓度为0.05 mg·mL-1时北虫草液体发酵培养得到的生物量最大;离子浓度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1时菌丝的萌发时间较短;离子浓度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1时菌球的生长状况最好;离子浓度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1时发酵液的相对性状最好。综合以上的数据分析可以得出，当锌离子浓度为0.05 mg·mL-1时单因素试验的结果最好，所以选择锌离子浓度为0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交试验，进一步探究二价盐离子对北虫草液体发酵培养的影响。

2.1.4 锰离子对北虫草液体培养的影响

根据试验得到锰离子浓度在0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1时北虫草菌丝的生长情况，通过数据分析、整理得到相关数据结果见表5。

根据表4的数据可以看出锰离子浓度对北虫草液体发酵生物量的影响。在离子浓度为0.02 mg·mL-1时北虫草液体发酵培养得到的生物量最大，菌丝的萌发时间较短，菌球的生长状况最好，发酵液的相对性状最好。综合以上的数据分析可以得出，当锰离子浓度为0.02 mg·mL-1时单因素试验的结果最好，所以选择锰离子浓度为0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1做正交试验，进一步探究二价盐离子对北虫草液体发酵培养的影响。

2.2 正交试验结果

根据正交试验通过数据分析、整理得到相关数据结果见表6。

由表6可以看出，试验6的菌丝生物量最高，达到0.432 9 g;其次是试验4，可达到0.411 5 g;试验7和试验9的菌丝生物量最低。通过极差分析的数据对比可以看出，4种二价盐离子对北虫草液体菌种菌丝生物量的影响顺序为A>C>B>D，其中A是影响北虫草液体菌种菌丝生物量的最主要因子，其次为C和B，对北虫草液体菌种菌丝生物量的影响最小的是D，再综合菌球生长状况和发酵液性状可以得出其最佳的培养组合为A2B1C1D2。

3 结论与讨论

本试验分别通过比较各二价盐离子对北虫草菌丝生物量、发酵过程中的相关生理特征的影响，运用科学的统计方法和数据分析手段进行试验以及结果分析，最终得出上述图表。通过对4种二价盐离子的单因素试验，结果表明，二价盐离子在较低浓度时对北虫草的生长和发育起到了明显的促进作用，在离子浓度进一步升高时，逐渐显现出了相应的抑制和毒害作用。根据单因素的试验结果，做正交试验，正交试验的结果表明当镁离子为0.10 mg·mL-1、钙离子为0.08 mg·mL-1、锌离子为0.02 mg·mL-1、锰离子为0.02 mg·mL-1时北虫草的菌丝干重达到最高，得到最佳二价盐离子组合为A2B1C1D2。

本试验因为实际试验室仪器和试验环境的限制，无法对优化的北虫草液体培养基培养过程中的各种理化性质进行分子水平鉴定，为了促使这四种二价盐离子更好更稳定地应用于生产，还需做后续的配套出菇试验，进行进一步的探索和研究。

参考文献：

[1] 于溢，安家彦.蛹虫草胞外多糖的提取和纯化[J].大连轻工业学院学报，2000，19（4）：268-270.

[2] 吕作舟.食用菌栽培学[M].北京：高等教育出版社，2010.

[3] 倪贺，李航海，黄文芳，等.北虫草及其活性成分的研究与开发[J].科技导报，2007，25（15）：75-79.

（责任编辑：赵中正）

收稿日期：2020-02-21

基金项目：陕西省重点研发计划一般项目“北虫草种质资源引进与栽培技术研究”（2020NY-078）;延安市重大科技成果转化资金专项项目“延安地区北虫草栽培技术示范与推广应用推广”（2017CGZH-03）;延安市重点研发计划产业关键核心技术创新项目“延安北虫草种质资源引进与栽培技术研究”;延安大学产学研合作项目“延安地区北虫草人工栽培及初加工研发与利用”（CYFP201902）;陕西省大学生创新创业训练计划项目“几种二价离子对北虫草人工栽培的影响”（S201910719008）。

作者简介：曹丹（1996—），女，陕西长武人，本科在读，研究方向为食用菌栽培。

为通信作者，E-mail： ydhelong@163.com。