代泳波 熊锐

硼酸（硼砂）曾作为食品防腐剂和膨松剂被用于水产品、肉制品及面食制品等食品中，但由于其具有较强毒性而被禁用，原卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单（第1-5批汇总）》中明确将硼酸与硼砂列入食品中可能违法添加的非食用物质名单，即任何食品中不得检出。食品中硼酸与硼砂检测方法依据《食品安全国家标准 食品中硼酸的测定》（GB 5009.275-2016），其原理为通过乙基己二醇-三氯甲烷溶液对样品中的硼酸（硼砂）进行快速的富集、萃取，除去共存盐类的影响，利用硫酸与姜黄混合生成的质子化姜黄与硼酸反应生成红色产物，溶液颜色的深浅与样品中硼酸（硼砂）含量成正比，通过分光光度计定量测定样品中硼酸（硼砂）的含量。但在实际样品检测过程中有时会出现同一浓度标准品的显色深浅有差异且标准曲线线性不好的情况，为探究导致显色不稳定的原因，按照实验步骤，根据日常检测过程中可能出现的因素逐步进行原因分析并设计以下实验。

一、实验材料

1.试剂：蒸馏水，无水乙醇（AR），冰醋酸（AR），三氯甲烷（AR），2-乙基-1，3-己二醇（AR），硼酸标准溶液（500μg/mL）。

2.仪器、器皿：双光束紫外可见分光光度计（TU1900北京普析通用仪器有限责任公司），涡旋振荡器（EYELA上海爱朗仪器有限公司），千分之一电子天平（JY203上海浦春计量仪器有限公司），50ml塑料离心管，100mL塑料容量瓶，200mL塑料烧杯，快速滤纸。

二、实验方法及结果分析

1.不同姜黄色素对显色的影响。GB 5009.275-2016中提到的显色剂为姜黄色素，姜黄色素是以姜黄素为主的一种黄色略带酸性的二苯基庚烃物质的统称，主要包括姜黄素（C21H20O6，分子量368，约占70%）、脱甲氧基姜黄素（C20H18O5，分子量338，约占15%）和双脱甲氧基姜黄素（C19H16O4，分子量308，约占10%），及四氢姜黄素、脱甲氧基四氢姜黄素、双脱甲氧基四氢姜黄素。检验过程中会使用到不同品牌的姜黄色素，为验证不同姜黄色素对显色的影响，在其他试剂及实验条件一致的情况下，使用5种姜黄色素做显色剂分别做标准曲线对比。试验结果如下。

根据图1数据可知，不同的姜黄色素，除了四氢姜黄素不显色外，其他色素均能显色且标准曲线均成直线，整体吸光度值略有差异。根据表3的数据可知，在能显色的色素中，不含硼酸时除进口姜黄素显红色外，其他姜黄素均为黄色，吸光度值差异不大；含有硼酸时，相同浓度下双去甲氧基姜黄素显色最浅，进口姜黄素显色最深，含甲氧基多的姜黄色素颜色深于含甲氧基少的姜黄色素，国产和进口的姜黄素显色深浅也不一样。因此在日常检测过程中出现显色不一致的情况，主要原因是使用了不同品牌的姜黄素，但只要使用能显色的姜黄色素，均能保证标准曲线线性正常，不会导致检测结果不稳定。

根据表4的验证结果来看，随着标准品过滤液静置时间的延长，显色略有加深，短时间内吸光度值变化不大。因此在样品检测过程中，如果因为检测样品过多导致样品待测液静置时间过长，并不会导致显色异常。

3.浓硫酸对显色的影响。浓硫酸在显色过程中的作用是将姜黄素质子化，再与硼酸发生显色反应。但是在日常检测过程中使用的浓硫酸不能保证每次都是同一品牌、同一级别、同一批次，且浓硫酸在使用过程中避免不了与空气接触而吸收空气中的水分。为验证浓硫酸对显色的影响，特设计如下实验：

（1）使用不同品牌、不同级别及不同批次的浓硫酸，其他条件一致，仅检测标准品吸光度值，验证数据见表5。根据表5的结果来看，无论是分析纯、优级纯还是不同品牌的硫酸，对显色不存在明显的差异。

（2）使用同一品牌、同一批次但启用时间不同的的浓硫酸，其他条件一致，仅检测标准品吸光度值，验证数据见图2。根据图2的验证结果，使用的浓硫酸会随启用时间的延长而导致显色越来越浅。当一瓶浓硫酸频繁开启使用或使用周期太长，就会导致显色非常浅且标准曲线线性差，影响检测结果。原因是高于70%浓硫酸都具有吸水性，频繁使用的浓硫酸会在使用过程中吸收空气中的水分导致浓度下降，如果在显色过程中使用了此类浓硫酸就会导致显色异常。因此在检测过程中要尽量选择新开启或开启时间不长的浓硫酸，从而保证检测结果准确且稳定。

4.显色时间及显色后静置时间长短对显色的影响。根据GB 5009.275-2016中5.2中关于显色的描述：“各取1.00mL过滤液于50mL塑料试管中，依次加入姜黄-冰乙酸溶液1.0mL、硫酸0.5mL，摇匀，静置30min，加无水乙醇25mL，静置10min。”其中對显色时间要求30min，对定容后静置时间要求10min，但是实际检测过程中，当检测样品数量较多时会出现实际显色时间和静置时间过长的问题，为验证该因素是否会对检测结果造成影响，设计如下实验：

（1）仅做标准曲线，减少前后时间差，其他条件完全一致，分别将显色时间设置为30-60min，查看显色情况，实验验证结果见表6。根据表6的验证数据，随着显色时间的延长，吸光度值略有上升但整体变化不大。

（2）仅做标准曲线，减少前后时间差，其他条件完全一致，分别将显色后静置时间设置为10-60min，查看显色情况，实验验证结果见表7。根据表7的验证数据，定容后静置时间超过10min，吸光度值几乎没有发生变化。因此检测样品数量较大导致显色时间和显色后静置时间过长并不会引起显色异常，不会影响检测结果。

5.检测环境温度对显色的影响。三氯甲烷和冰醋酸具有刺激性，必须在通风柜中进行操作，而通风柜中很难控制环境温度，不同季节的环境温度差异也较大。为验证在不同温度下的显色情况，特设计如下实验：将处理后的标准品过滤液和显色所需浓硫酸、姜黄色素和定容用乙醇分别置于室温下通风柜（约20℃）、鼓风冷藏柜（约5℃）和鼓风恒温箱（约35℃）中，在测量吸光度值前的操作全部置于各自温度条件中进行，显色后测量吸光度值，实验验证结果见表8。

根据表8的验证结果，在不同温度下，同一浓度标准品过滤液吸光度值变化不大，因此不会出现因为环境温度的不同而导致显色异常。

综合以上实验得出如下结论：按照G B 5009.275-2016检测硼酸的过程中，出现显色情况不一致是使用不了不同的姜黄色素，不同的姜黃色素显色会有深浅差异，部分色素存在红色本底，但不影响标准曲线和检测结果。而日常的检测过程中可能遇到的样品待测液静置时间过长、显色反应时间过长、定容后静置时间过长、反应温度过低过高都不会对显色造成明显的影响。影响检测结果稳定性的因素是使用了不同浓度的浓硫酸，如果浓硫酸开启时间过长且期间反复使用，会导致浓硫酸吸水而浓度下降，使用了浓度下降的浓硫酸进行显色反应会导致显色异常，造成检测结果不稳定。为保证检测过程中显色稳定，需使用新开启的浓硫酸或开启后使用次数较少、保存良好的浓硫酸。