吴昊星 刘百红 刘雪微 周景云 马永缨 杨欣艳 李宝春 陈西钊

（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100089）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是一种由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的高度接触性传染病，对全球范围内的养猪业造成巨大经济损失［1-2］。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020 年）》中将其列为5 种优先防治的动物疫病之一［3］。当前CSF 防治的主要手段是疫苗接种，其中中国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在中国乃至世界范围内CSF 的防控起到了积极作用［4］。CSFV 基因组编码4 个结构蛋白（Npro、Erns、E1 和E2）和8个非结构蛋白（C、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）［5-6］。E2 是CSFV 最重要的具有免疫原性的蛋白之一，诱导机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染，是研究新型基因工程疫苗和血清学抗体检测方法的首选靶蛋白［7-10］。蔺辉星等［11］以原核表达的E2 蛋白建立了检测CSFV 血清抗体的间接ELISA 检测方法，其敏感性、特异性和符合率分别为89.07%、77.59%和84.65%。肖丽等［12］通过液相芯片新技术分别以原核表达CSFV E2 蛋白和PCV2 Cap 蛋白，与荧光微球偶联建立了一种同时检测CSFV、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）抗体的方法临床样品符合率分别是90.48%、60.32%。袁莉等［13］利用重组抗原E2、Erns和C蛋白建立的CSFV 血清抗体ELISA 检测方法，可以用于评价CSF 疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点，从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。

本研究基于镧系元素Eu 微球标记技术建立了一种CSFV 抗体检测的免疫层析方法，结合荧光分析仪，可以快速方便的对猪场的血清样品进行检测，无需大型昂贵的仪器。解决了中小型养殖场实验室简陋问题，可广泛的应用于猪场中CSFV抗体的监测。

1 材料与方法

1.1 材料

CSFV E2 抗原由中国兽医药品监察所表达纯化后提供；鼠IgG、羊抗鼠IgG 购自于杭州隆基公司；Eu 纳米微球购自于Bangs 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自于赛默飞世尔科技有限公司；活化缓冲液：50 mmol/L MES 用NaOH 调pH 为6.0；偶联缓冲液：50 mmol/L HEPES 用NaOH 调pH 为8.0；封闭液：用水溶解酪蛋白钠，终浓度为5%；样本处理 液：0.1 mol/L Tris、0.1% Casein、0.1% Tween-20用盐酸调pH 到7.4；P：CSFV 抗体阳性猪血清；N：CSFV 抗体阴性猪血清；猪瘟阳性血清国家参考品购自中国兽医药品监察所，细胞中和效价为1∶（2 138±2）。猪瘟病毒抗体ELISA 检测试剂盒购自于北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。CSFV 强阳性样本（CV1），CSFV 中阳性样本（CV2），CSFV弱阳性样本（CV3）。

AFS-1000 干式荧光分析仪（广州蓝勃公司）；XL-2120 超声波清洗仪（北京协力共创公司）；D-37520osterode 高速台式冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；XYZ30600128 划膜仪（Biodot 公司）；ZQ400 斩切机（购自于上海金标公司）；硝酸纤维素膜（Sartorius 公司）；玻璃纤维、吸水纸、PVC 板（上海杰一生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试纸条的制备

1.2.1.1 微球标记 （1）用500 μL 活化缓冲液洗涤10 μL（0.1 mg）微球溶液1 次，离心，去上清；取出EDC 放室温（要扭紧盖子）；（2）分别用250 μL活化缓冲液洗涤重悬颗粒，超声1 min，务必使微球充分悬浮；（3）分别加入250 μL 含0.005 mg EDC的活化缓冲液，使终体积均为500 μL；（4）室温下（18-25℃）持续混匀反应25 min，离心；（5）分别用偶联缓冲液洗涤2 次，离心，去上清；重悬于250 μL 偶联缓冲液中，充分悬浮；（6）加入250 μL的抗原-偶联缓冲液，立即轻轻上下混匀；（7）室温下持续混匀反应3 h，离心，去上清；（8）分别加入500 μL 封闭液，洗涤2 次，沉淀用500 μL 封闭液重悬，超声1 min，室温下持续混匀反应过夜，离心，去上清；加入500 μL 保存液，洗涤2 次，用500 μL保存液重悬，超声1 min；（9）保存在2-8℃冰箱备用。

1.2.1.2 NC 膜制备 将划线抗原用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸缓冲液稀释，羊抗鼠IgG 抗体用含1%蔗糖，pH8 的5 mmol/L 硼酸缓冲液稀释为1.5 mg/mL。用喷膜仪以50 mm/s 的速度、1 μL/cm的浓度，在室内环境中，分别将划线抗原、羊抗鼠IgG 抗体喷在NC 膜（2.5 cm×30 cm）的T 线、C 线位置，37℃烘箱中烘干2 h 备用。

1.2.1.3 结合垫的制备 以聚脂纤维膜（1 cm×2.5 cm）作为结合垫材料，用结合垫处理缓冲液浸湿，37℃烘箱中烘干后将自制的荧光微球-标记抗原复合物溶液用喷膜仪以50 mm/s、6 μL/cm 的浓度喷于结合垫上，37℃烘箱中烘干3 h 备用。

1.2.1.4 样品垫的制备 以玻璃纤维素膜（1.5 cm×30 cm）作为样品垫材料，用样品处理缓冲液浸湿，37℃烘箱中烘干4 h 备用。

1.2.1.5 吸水纸的剪切 剪好1.5 cm×30 cm 的吸水纸，备用。

1.2.1.6 检测试纸的组装 组装环境要求：常温，湿度低于30%。根据上述步骤制备的样品垫、结合垫、NC 膜和吸水纸依照图1 所示的重叠关系将其依次贴在带有粘合剂的PVC 底板（8 cm×30 cm）上，具体 为：将NC 膜非点样面粘贴于PVC 底板；荧光垫粘贴在NC 膜的上方，覆盖NC 膜1 mm；吸水垫粘贴在NC 膜的上方，覆盖NC 膜2 mm；样品垫粘贴在荧光垫的上方，覆盖荧光垫2 mm；在斩切机中将粘贴好的检测板剪切成4 mm 宽的试纸条，装在试纸条外壳中，制成带有结果观察窗和加样口的检测卡。用AFS-1000 荧光分析仪检测荧光信号，记录T/C 读值（图1）。

图1 荧光试纸条结构示意图

1.2.2 试纸条反应体系优化

1.2.2.1 结合垫复溶浓度的优化 按照1.2.1 标记抗原，纳米微球标记好的抗原用结合垫处理液复溶，复溶浓度选择2、4、6、8、10 倍复溶，喷膜仪以50 mm/s、6 μL/cm 的浓度喷于结合垫上，37℃烘箱中烘干3 h 备用。然后组装成试纸条检测临床样本，依据荧光信号值、P/N 比值确定合适的复溶浓度。

1.2.2.2 包被浓度优化 包被抗原含量优化：将划线抗原用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸缓冲液稀释为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，羊抗鼠IgG 抗体用含1%蔗糖，pH=8 的5 mmol/L 硼酸缓冲液稀释为1 mg/mL。用喷膜仪以50 mm/s 的速度、1 μL/cm 的浓度，在室内湿度为45%-65%的条件下，分别将划线抗体、羊抗鼠IgG 抗体喷在NC 膜（2.5 cm×30 cm）的T 线、C 线位置，37℃烘箱中烘干2 h 备用。

1.2.2.3 反应时间优化 加样后5 min、8 min、10 min、13 min、15 min、20 min、25 min、30 min 读取数据，绘制时间曲线，以P/N、读数稳定且时间最短为优，确定加样反应时间。

1.2.3 性能评价

1.2.3.1 敏感性试验 对猪瘟阳性血清国家参考品按 照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、 1∶256 进行稀释，记录结果。

1.2.3.2 特异性试验 与猪繁殖与呼吸综合征病、猪I 型疱疹病毒、猪口蹄疫病、猪圆环2 型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等阳性血清进行交叉反应试验。

1.2.3.3 重复性试验 对CSFV 抗体阳性样本P 连续加样10 次，计算试纸条变异系数（CV）。

1.2.3.4 临床评价 采用试纸条、猪瘟病毒抗体ELISA 检测试剂盒（Anheal-ELISA）以及荧光抗体中和试验（FVNT）同时检测131 份猪血清，计算试纸条与Anheal-ELISA 和FVNT 符合率。

2 结果

2.1 试纸条反应体系的优化

2.1.1 结合垫复溶浓度的优化 从图2 中可以看出在复溶度稀释6 倍的时候，T/C 比值较高，P/N 比值最大。因此选择复溶度为6 倍时稀释度最佳。

图2 不同复溶度与T/C 比值、P/N 比值的变化

2.1.2 包被浓度优化 从下图3 中可以看出，在T线浓度为0.1 mg/mL 时，P/N 比值最大。因此T 线浓度选择0.1 mg/mL 为最佳浓度。

图3 不同包被浓度与T/C 比值、P/N 比值变化

2.1.3 反应时间优化 从图4 可以看出在15-20 min时，T/C 比值变化不大，13 min 以后P/N 比值逐渐降低，综合考虑选择检测时间为15 min。

图4 不同检测时间与T/C 比值、P/N 比值变化

2.2 性能评价

2.2.1 敏感性 以T/C ≥0.1 时为阳性，将猪瘟阳性血清国家参考品按照倍比稀释到128 倍仍为阳性，如图5。

2.2.2 特异性 从图6 可以看出猪瘟阴性血清的测定值与猪繁殖与呼吸综合征病、猪I 型疱疹病毒、猪口蹄疫病、猪圆环2 型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等阳性血清测定值小于0.1。故本方法针对这7 种动物疫病阳性血清无交叉反应。

2.2.3 重复性 从表1 中看出，CSFV 抗体荧光试纸条批内和批间CV 均小于10%。

图5 猪瘟阳性血清稀释倍数与T/C 比值的关系

图6 CSFV-Ab 纳米荧光试纸条交叉反应性

表1 CSFV 抗体纳米荧光试纸条重复性

2.2.4 临床评价 从表2 中可以看出试纸条与FVNT的阴性符合率为100%，阳性符合率为93%，总符合率为98.5%。从表3 中可得出试纸条与Aheal-ELISA的阴性符合为100%，阳性符合率为90%，总符合率为97.7%。

表2 FVNT 试验与试纸条检测结果统计

阳性符合率=26/（26+2）×100%=93%

阴性符合率=103/（103+0）×100%=100%总符合率=（103+26）/131×100%=98.5%

表3 与Anheal-ELISA 与试纸条检测结果统计

3 讨论

猪瘟是一种高度传染性疫病，是威胁养猪业的主要传染病之一［14-15］。急性型猪瘟呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性型猪瘟呈纤维素性坏死性肠炎。目前主要通过扑杀与疫苗预防接种相结合等手段，北美、加拿大、新西兰等很多国家已成功实现猪瘟净化，但在中国猪瘟仍是严重危害养猪业的重大传染病之一，存在不间断流行［16］。CSFV 为有囊膜、直径40-60 nm、单股正链RNA 病毒［17］。目前已经定位的CSFV 蛋白有5 种，即 Npro、C、Erns（E0）、E1 和E2。它们均由CSFV 的 RNA-ORF 5′一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫研究价值的是Erns和E［9，18-19］。E2 蛋白是CSFV 主要的抗原蛋白，可诱导猪机体产生病毒中和抗体，从而预防集落刺激因子（Colony stimulating factor，CSF）［20］。

目前市场上猪瘟抗体的检测方法，以酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析技术的方法为主。商品化的猪瘟抗体酶联免疫吸附试验检测试剂主要厂家有IDEXX、Biocheck 等，酶联免疫吸附试验的方法需要专业的设备，对人员的操作技能要求比较高，不利于在基层开展工作。商品化的猪瘟抗体胶体金检测试剂的厂家有北京世纪元亨、武汉科前等，胶体金的方法不可以准确的定量，且灵敏度不高，准确性差。而时间分辨荧光分析法是一种新型的非放射性微量分析技术［21］。它是目前最灵敏的微量分析技术之一，其灵敏度高达10-12g/mL，较胶体金法（Colloidal gold immunoassay，GIA）高出3 个数量 级［22］。本技术利用镧系微球通过共价偶联标记抗原或抗体，相对物理偶联，化学偶联更加结实，不易脱落。用荧光分析仪测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。本技术除满足了高灵敏检测的需求，同时也不需要复杂的设备，操作简单方便，符合基层的工作情景。在市场上，并没有发现具有农业部备案的商品化猪瘟病毒抗体荧光检测试剂。因此本文建立的猪瘟抗体的荧光检测方法具有一定的技术优势。

冯春花等［23］利用E2 建立了一种猪瘟病毒血清抗体间接ELISA 检测方法，该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪I 型疱疹病毒（Pseudorabies virus，PRV）、 猪 圆 环 病 毒（Porcine circovirus，PCV）、猪细小病毒（ Porcine parvovirus，PPV）阳性血清均无交叉反应；随机检测80 份猪血清样品，与进口阻断ELISA 试剂盒相比其阳性符合率为83.58%、阴性符合率为76.92%，总体符合率为80.25%。本研究的试纸条测定临床血清阳性符合为90%、阴性符合率为100%，总符合率为98%。本试纸研制采用双抗原夹心的方法，利用常用的Eu 微球作为标记物，对E2 抗原进行共价耦合连接标记，在NC 膜上包被真核表达的猪瘟E2 抗原，经优化最终确定包被浓度为0.1 mg/mL，复溶浓度为6 倍稀释，检测时间为15 min。通过对试纸条的性能评价可以得出，猪瘟抗体荧光检测试纸条的敏感性为猪瘟阳性血清国家参考品稀释128 倍仍可以检测到，对常见的猪繁殖与呼吸综合征病、猪I 型疱疹病毒病、猪口蹄疫病、猪圆环、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等疾病抗体阳性血清无交叉反应，批内和批内的变异系数均小于10%，试纸条与Anheal-ELISA 的阴性符合为100%，阳性符合率为90%，总符合率为97.7%。试纸条与FVNT 的阴性符合率为100%，阳性符合率为93%，总符合率为98.5%。

4 结论

基于镧系元素Eu 微球标记技术，经一系列反应体系的优化，建立了一种猪瘟病毒抗体检测的免疫层析方法，并经对试纸条灵敏度、特异性、重复性等性能指标的优化，结果满足试剂性能要求，表明可广泛的用于猪场中猪瘟病毒抗体的免疫评估，辅助进行疫苗免疫策略的调整，建立合理的免疫 程序。