刘霞*，杨莹，刘剑辉

赣南医学院（赣州 341000）

杜仲叶为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides）的干燥叶[1]，其药理作用十分显著，对于防治骨质疏松、改善疲劳、防止衰老、增强机体免疫功能和降血压等具有较好的效果，和杜仲皮的有效成分和药理作用相似[2-3]。杜仲叶绿原酸是杜仲中重要的药物活性物质之一，其抗氧化作用和抑菌活性较强，对多种菌如大肠杆菌、乳房链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌等均具有抑制作用[4-5]。目前关于杜仲叶中绿原酸的提取方法常用的有超声法[6]、微波辅助提取法[7]及生物酶法[8]等。但这些方法存在成本高、溶剂耗量大且提取率低等问题。研究一种工艺条件温和、操作简便、成本低且提取率高的绿原酸提取工艺对杜仲产业的发展意义重大。

聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）-200成本较低、不易挥发、性质比较稳定、安全无毒，是一种环保溶剂[9]。纤维素酶法能有效水解细胞壁上的纤维素，加速有效成分溶出，从而提高提取效果[10-11]。目前采用酶法辅助PEG-200提取杜仲叶绿原酸的研究仍鲜见报道。试验以杜仲叶为原材料，采用酶法辅助PEG-200提取绿原酸，并用Box-Behnken中心组合试验方法优化其提取工艺，从而为杜仲叶资源的综合开发利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

杜仲叶药材，市售，经赣南医学院程齐来教授鉴定为杜仲科植物杜仲的叶。

绿原酸对照品，天津一方科技有限公司；纤维素酶（5×104U·g-1），江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光谱仪，德国耶拿分析仪器股份公司；HWS-12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；SQP型电子天平，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；FS500Y-3型摇摆式粉碎机，广州雷迈机械设备有限公司；Hei-VAP Value Digital G3旋转蒸发仪，德祥Tengent；SHA-C数显水浴恒温振荡器，金坛市城东新瑞仪器厂；SHZ-III循环水式真空泵，上海亚荣生化仪器厂；DHG9246A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；PB-10酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取10.16 mg的绿原酸标准品，用30% PEG-200定容至100 mL，配制101.6 μg·mL-1的母液，再精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL母液，分别置于10 mL容量瓶中，加30% PEG-200至刻度，摇匀，静置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1的标准溶液。测定各标准溶液在329 nm的吸光度。以吸光度A为纵坐标，绿原酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线：A=0.051C+0.003 9，R2=0.999 8。

1.2.2 杜仲叶绿原酸的提取

将50℃恒温烘干后的杜仲叶粉碎，过60目筛。准确称取5.0 g杜仲叶粉末，置于250 mL具塞锥形瓶中，按不同的料液比加入30%的PEG-200，盐酸调pH，充分搅拌，再添加适量的纤维素酶，在不同温度下恒温酶解一定时间后，在80℃条件下回流提取15 min，趁热过滤，滤液适当减压浓缩，并用30% PEG-200定容于50 mL的容量瓶中，备用。

1.2.3 绿原酸提取率测定

精密量取上述提取液，并按一定比例稀释后，按照标准曲线下的测定方法测吸光度，计算绿原酸提取率。

1.2.4 单因素试验

采用单因素试验研究酶用量、料液比、酶解温度、pH及酶解时间对杜仲叶绿原酸提取效果的影响。

1.2.5 响应面试验设计

根据单因素试验结果，酶解温度对绿原酸提取率影响不大，固定酶解温度50℃。以酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）及酶解时间（D）为自变量，以-1，0和+1代表自变量的低、中、高水平，以绿原酸提取率为响应值进行响应面分析。试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量对杜仲叶绿原酸提取率的影响

由图1可以看出，当酶用量逐渐增加至1.2%时，绿原酸提取率增幅较大；当酶用量超过1.2%时，绿原酸的提取率反而呈下降趋势。这是因为酶用量增加到一定程度时，酶与底物浓度处于相对饱和状态，继续增加酶用量，会导致部分酶不仅不能与底物结合，反而会抑制绿原酸成分的浸出，因而绿原酸提取率有所下降[12]。因此选择酶用量的比例为1.2%。

2.1.2 料液比对杜仲叶绿原酸提取率的影响

由图2可知，随着料液比逐渐增加，绿原酸提取率先增加后降低，当料液比为1∶25（g/mL）时绿原酸提取率达到最大值，之后提取率开始下降，因此选择1∶25（g/mL）为最佳料液比。

图1 酶用量对绿原酸提取率的影响

图2 料液比对绿原酸提取率的影响

2.1.3 酶解温度对杜仲叶绿原酸提取率的影响

由图3可以看出，随着酶解温度的增加，绿原酸提取率先逐步增加。当酶解温度为50℃时，绿原酸提取率达到最大值。后续随着酶解温度的增加，绿原酸提取率开始下降。这是因为纤维酶的活力都有最适温度，偏离最适温度会引起酶的失活[13]。因此，试验的酶解温度定为50℃。

图3 酶解温度对绿原酸提取率的影响

2.1.4 pH对杜仲叶绿原酸提取率的影响

由图4可知，随着pH的增加，绿原酸提取率先呈上升趋势。当pH达到4.5时，提取率达到最大值，而后提取率逐步下降。这可能是酸性纤维素酶在pH 4.5时活力作用最强，稳定性最好。故试验选择最佳pH 4.5。

2.1.5 酶解时间对杜仲叶绿原酸提取率的影响

由图5可知，随着酶解时间的增加，绿原酸提取率先呈逐步上升趋势。当酶解时间为2 h时，提取率达到最大值，之后继续延长酶解时间，提取率明显下降。这是由于绿原酸本身的不稳定性，长时间加热会导致部分绿原酸发生异变和分解，因而提取率下降。故试验将最佳酶解时间定为2 h。

图4 pH对绿原酸提取率的影响

图5 酶解时间对绿原酸提取率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

响应面分析方案与结果见表2。应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得出方差分析表，见表3。

通过多元回归拟合分析得到杜仲叶中绿原酸提取率（Y）与酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）和酶解时间（D）之间的二次多项回归方程：Y=-17.705 4- 1.362 5A-0.146 8B+10.488 3C-0.196 7D+0.105 0AB+ 0.275 0AC-0.450 0AD+0.037 0BC+0.050 0BD+0.190 0CD- 0.802 1A2-4.483 3E-003B2-1.333 3C2-0.398 3D2。

由表3可以看出回归方程的p＜0.01，表明此回归模型达到极显著水平。模型的相关系数R2=95.65%，调整系数R2Adj=91.31%，均大于90%，表明方程对试验拟合良好，试验结果误差小，可用于拟合杜仲叶中绿原酸的最佳提取工艺。一次项A、B、C、D，交互项AB、AD、BC、BD，二次项A2、B2、C2、D2对试验结果影响显著（p＜0.05），表明酶用量、料液比、pH和酶解时间对杜仲叶中绿原酸提取率影响显著，且影响顺序（主→次）为酶用量＞酶解时间＞料液比＞pH。交互项AD、BC的p＜0.05，表明酶用量与酶解时间、料液比与pH的交互作用对杜仲叶中绿原酸提取率影响显著，交互项AB、BD的p＜0.01，表明酶用量与料液比、料液比与酶解时间的交互作用对杜仲叶绿原酸的提取率影响达到了极显著的水平。

表2 Box-Behnken中心组合试验结果

表3 响应面方差分析结果

2.2.2 响应面交互作用分析及最佳提取工艺研究

各试验因素间的交互作用对杜仲叶绿原酸提取率影响的3D分析结果见图6。由图6可知，酶用量对杜仲叶绿原酸提取率影响最显著，表现为响应曲面坡度较陡峭；酶解时间和料液比影响次之，表现为曲面稍平滑；最后为pH，表现为曲面更平缓。各试验因素间的交互作用对杜仲叶绿原酸提取率影响与表3中交互相的方差分析结果一致。

根据Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行优化分析，得到最佳工艺参数：酶用量0.8%，料液比1∶20（g/mL），pH 4.4，酶解时间1.6 h。在此工艺条件下进行3次平行试验，结果得到的实际提取率为3.15%，与预测值3.23%相差较小，相对误差为2.48%，说明此模型合理可靠，能够较好地拟合杜仲叶绿原酸的提取过程。

图6 各两因素交互作用对杜仲叶绿原酸提取率影响的响应面图

2.3 不同提取方法的对比

由表4可知，相比单技术回流法，酶法联合回流法提取杜仲叶中绿原酸虽耗时更长，但得率提高近1倍，说明在回流法的基础上增加酶预处理步骤可有效提高杜仲叶中绿原酸的得率。

表4 不同提取方法提取绿原酸的比较（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取绿原酸的比较（±s，n=3）

序号 提取方法 提取时间 杜仲叶绿原酸提取率/%1 酶法联合回流法 1．85 h 3．15±0．32 2 回流法 15 min 1．87±0．19

3 讨论与结论

通过响应面分析方法的优化，采用酶法辅助PEG-200提取杜仲叶中绿原酸的最佳工艺条件为：酶用量0.8%、料液比1∶20（g/mL）、pH 4.4、酶解时间1.6 h。在此试验条件下实际提取率为3.15%，与预测值基本一致，说明此模型合理可靠，可以很好地分析和预测杜仲叶中绿原酸的提取工艺。此法相比单技术回流法，虽耗时更长，但得率提高近1倍，说明在回流法的基础上增加酶预处理步骤可有效提高杜仲叶中绿原酸的得率。此研究结果可为绿原酸提取纯化工艺的进一步研究提供一定的参考依据。