朱迪冰，赵海燕，何建丹，杜雨涵，王少兵

(中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074)

姜黄素(Curcumin，Cur)是从姜科植物姜黄、郁金、莪术等根茎中提取出来的主要成分，是植物界天然的二酮类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等多种药理活性，且不良反应轻微，药源充足，极具开发前景[1-2]。姜黄素可以治疗阿尔兹海默病症，它还可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，改变细胞受体连接以及调控细胞凋亡信号来控制肝肿瘤细胞的产生、增加和转移，所以常用于肝癌等的治疗[3]。而由于姜黄素本身的限制条件，水溶解度较低，不易进入细胞，在体内半衰期短，代谢快，生物利用度较低，稳定性差，不利于药物发挥作用[4]。因此研究影响姜黄素稳定性对于姜黄素制剂的开发具有重要意义。

PLGA纳米粒作为药物载体，生物相容性好，具有良好的生物降解性，无刺激性，毒副作用小，经酯键断裂降解为乳酸和羟基乙酸，通过三羧酸循环被代谢为二氧化碳和水从体内排出。PLGA纳米粒在降解时，纳米粒表面会逐渐产生微孔，使药物暴露在纳米粒表面逐渐溶解释放，达到长效缓释目的。纳米粒具有靶向性，可以通过胞饮作用或者吞噬作用直接进入细胞，因而可以避免细胞膜上的外排泵对药物的外排作用，防止药物被内皮网状系统吞噬，从而提高疗效[5]。

本研究通过单因素试验，采用PLGA为载体材料，PVA为乳化剂，以粒径、包封率和载药量为指标筛选出姜黄素PLGA纳米粒的最优处方，并对其结构进行了表征，为后续开发姜黄素的新制剂提供了依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱仪(Agilent 1100型，美国Agilent公司)；高速离心机(TGL-16C，上海)；超声波细胞破碎仪(JY96-IIN，上海沪析实业有限公司)；循环水式多用真空泵(SHZ-D(III)，河南省予华仪器有限公司)；数显恒温磁力搅拌器(85-2，金坛市科兴仪器厂)；傅里叶变换红外光谱仪(NICOLET 6700型，美国Thermo Scientific)；X射线衍射仪(XRD，D8型，德国Bruker)。

材料：姜黄素(Cur)，PLGA(50∶50，分子量5.5万，济南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇(88%水解度，上海威呈化工有限公司)；甲醇(色谱纯，美国天地)；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：Dikma Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.5%乙酸水(80∶20)，柱温：25 ℃，流速：1.0 mL/min，检测波长：450 nm，进样量：10 μL。

1.3 PLGA纳米粒制备

采用乳化溶剂挥发法制备Cur-PLGA-NPs[6]，取20 mg PLGA溶于1 mL有机溶剂中，随后将一定量药物粉末溶于聚合物溶液中。所得的溶液逐滴加入2 mL 2% PVA水溶液中，冰浴中超声20 min得到初乳。将初乳滴加到10 mL 0.5% PVA水溶液中，减压蒸发1 h。5 000 rpm离心10 min除去大颗粒和析出的药物，上清液在4 ℃、20 000 rpm离心30 min收集纳米粒，再用适量蒸馏水洗涤2次，重新分散在少量蒸馏水中，冷冻干燥收集的纳米粒，于低温冷冻干燥机中干燥24 h，得到Cur-PLGA-NPs。

1.4 包封率和载药量的测定

精密称取5 mg Cur-PLGA-NPs，充分溶解于5 mL甲醇中，超声20 min，通过0.22 μm微孔滤膜，HPLC法测纳米粒中姜黄素含量。

包封率计算公式：EE%=实测载药量/理论载药量×100%

载药量计算公式：DL%=纳米粒中测得的药物总量/纳米粒总质量×100%

1.5 粒径与粒径分布

将Cur-PLGA-NPs重新分散在蒸馏水中配制成混悬液，置于动态光散射仪样品池中进行测定。

1.6 性能表征

透射电镜(TEM)：将Cur-PLGA-NPs冻干粉样品分散在蒸馏水中稀释成适当浓度，将铜片浸泡在样品溶液一段时间后自然干燥，TEM观察并拍照。

X射线衍射(XRD)：取Cur、PLGA、Cur与PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs冻干粉进行XRD射线衍射分析，工作条件：Cu靶，石墨单色器衍射单色化，管电压50 kV，管电流200 mA，扫描范围2θ为5° ～80°[7]。

差示扫描量热法(DSC)：将Cur、PLGA、Cur与PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs冻干粉分别装入铝坩埚中，在静态的空气环境中测定，称样量约5 mg，升温速度为10 ℃·min-1，温度范围为0～200 ℃。

红外光谱(IR)：采用溴化钾压片法将Cur、PLGA、Cur和PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs冻干粉分别制备成样品后进行红外扫描分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间考察 按照“1.3”项下制备方法，保持其他条件不变，分别改变超声时间，测定药物的粒径和载药量。试验结果见表1。由表1可知，当超声时间超过20 min时，粒径和载药量无明显变化，因此选择超声时间为20 min。

表1 超声时间对粒径和载药量的影响

2.1.2 有机溶剂对粒径和载药量的影响 按照“1.3”项下制备方法，保持其他条件不变，改变有机溶剂丙酮与二氯甲烷比例，测定药物的粒径和载药量，结果见表2。由表2可见，当二氯甲烷混有丙酮时，粒径明显降低，但随着丙酮含量的增高，粒径无明显影响，可能的原因是二氯甲烷为水性不溶性溶剂，当含有载体材料的二氯甲烷滴入水中，会形成油滴，这些油滴仅能依靠机械搅拌作用分散在水中，故形成的纳米粒粒径较大，而对于水溶性的丙酮，当含有聚合物的有机溶剂被滴入水相时，溶剂会立刻分散在水中，聚合物不易聚集在一起，故形成的纳米粒粒径较小[8]。

随着丙酮含量的增加，载药量降低，分析其原因可能是溶剂极性过高，药物容易朝水中泄露，因此选择丙酮∶二氯甲烷体积比为1∶4。

表2 有机溶剂对粒径和载药量的影响

2.1.3 Cur投药量的考察 按照“1.3”项下制备方法，保持其他条件不变，姜黄素投药量分别为1 mg、1.5 mg、2 mg、4 mg时，纳米粒的包封率和载药量如图1。由图1可见，包封率随着Cur的投药量增加而降低，而载药量增高，由于当投入Cur为4 mg时，包封率大幅降低，因此选择Cur投药量为2 mg。

图1 Cur与PLGA比例对包封率和载药量的影响

2.1.4 初乳中PVA体积和浓度的考察 按照“1.3”项下制备方法，Cur 1.5 mg，PLGA 20 mg，其他条件不变，考察初乳中PVA浓度和体积对包封率和载药量的影响。结果见图2和图3。

图2 PVA浓度对包封率和载药量的影响(一)

图3 PVA体积对包封率和载药量的影响(二)

由图2可知，当PVA体积分别为1、2、3、4 mL时，包封率和载药量均先增加后降低，可能的原因是当水相和油相比例为1∶1时，不易形成水包油，当水相比例过大，导致初乳稳定性降低，药物容易朝水相中泄露，因此选择初乳水相体积为2 mL。

由图3可知，当PVA的浓度分别为1%、2%、4%时，包封率和载药量都是先增加后降低，可能的原因是PVA是乳化剂，PVA浓度在一定范围内，对初乳的乳化效果会更好，因此可以装载更多的药物，但是当PVA浓度继续增大，包封率和载药量开始下降，可能是因为高浓度PVA溶液过于黏稠，导致药物更容易扩散进入水相，因此选择PVA浓度为2%。

2.2 最优处方及三批重现

根据单因素试验，筛选出最优处方为Cur 2 mg，PLGA 20 mg，有机溶剂组成为丙酮∶二氯甲烷=1∶4，初乳中PVA体积2 mL，浓度2%，超声时间20 min。在最优处方下制备的3批Cur-PLGA-NPs包封率、载药量和粒径如表3所示。

表3 Cur-PLGA-NPs的包封率、载药量和粒径

2.3 CUR-PLGA-NPs的表征

2.3.1 透射电镜法(TEM) Cur-PLGA-NPs的TEM图像如图4所示，纳米粒微观形态呈较规则的球形或类球型，均在纳米尺寸范围内，表明圆整光滑。

图4 Cur-PLGA-NPs的TEM图像

2.3.2 红外光谱分析(IR) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs冻干粉的IR图谱如图5。图5显示Cur在3 507.33 cm-1有-OH特征吸收峰，在1 629.65和1 598.78处有C=O特征吸收峰。PLGA在1 747 cm-1处有C=O伸缩振动产生的吸收峰。在包封的纳米粒中，上述峰均存在，因此没有新的化学键的形成。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

2.3.3 差示扫描量热法(DSC) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs的DSC图谱见图6。由图6可见PLGA聚合物在50 ℃左右显示出1个小峰，指的是玻璃化转变后的弛豫峰，没有观察到明显的熔点，因为PLGA本质上是无定形的。Cur在174.7 ℃产生对应于结晶区熔点的尖峰，物理混合物也在此处出现了熔融吸热峰，然而，在Cur-PLGA-NPs中未观察到Cur的特征峰，这可能是由于Cur的结晶形式转化为无定形形式[9]。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

2.3.4 X射线衍射(XRD) 为了进一步了解Cur和PLGA聚合物之间的相互作用，使用X射线衍射(XRD)，结果如图7。由图7可知，Cur的晶体特征峰并未在Cur-PLGA-NPs中显示。这一现象可能表示了Cur的晶体形式转变为非晶态形式，这与DSC的结果一致。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

3 结论

以PLGA为载体材料，PVA为乳化剂，采用乳化溶剂挥发法制备了Cur-PLGA-NPs，以包封率、载药量和粒径筛选了最优处方为：Cur 2 mg，PLGA 20 mg，有机溶剂组成为丙酮∶二氯甲烷=1∶4，初乳中PVA体积2 mL，浓度2%，超声时间20 min。在最优处方下制备的Cur-PLGA-NPs进行了表征，包封率为(49.1±1.68)%，载药量为(4.5±0.15)%，平均粒径为(167.5±4.3)nm。IR、XRD、DSC结果显示，药物晶态转变为无定型状态，药物与载体之间不存在相互作用力。本实验成功制备Cur-PLGA-NPs，为Cur-PLGA-NPs的体内研究奠定了基础。