邵彪　周小兰　王琳琳　尤嘉　陈刚

摘 要：基于凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）净化处理，建立辐照肉制品中2-十二烷基环丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB）的气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）检测方法。样品经正己烷超声提取、GPC净化及氮吹浓缩等步骤处理后，利用GC-MS/MS多反应监测模式进行分析。结果表明：2-DCB在质量浓度10～1 000 μg/L范围内线性良好，线性方程为y=383 709.18x-4 686.41，相关系数为0.998 3;25、100、400 μg/kg 3 个加标水平的平均回收率为78.2%～105.5%，相对标准偏差小于7.3%;检出限和定量限分别为1.8、6.0 μg/kg。该方法前处理操作简单、可实现自动化批量处理，同时具有较高灵敏度。

关键词：凝胶渗透色谱;辐照肉制品;气相色谱-串联质谱;2-十二烷基环丁酮

Detection of 2-Dodecylcyclobutanone in Irradiated Meat Products by Gel Permeation Chromatography

Followed by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Biao1， ZHOU Xiaolan2， WANG Linlin1， YOU Jia3， CHEN Gang1，*

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute， Nantong 226011， China; 2.Nantong University Analysis and Testing Center， Nantong 226019， China; 3.Nantong Food and Drug Supervision and Inspection Center， Nantong 226006， China）

Abstract： Based on clean-up by gel permeation chromatography （GPC）， a method for the determination of 2-dodecylcyclobutanone （2-DCB） in irradiated meat products by gas chromatography-tandem mass spectrometry

（GC-MS/MS） was established. Samples were subjected to sequential ultrasonic extraction with n-hexane， purification by GPC， concentration and nitrogen blowing evaporation to dryness before being analyzed by GC-MS/MS. The results showed that a linear calibration curve in the concentration range of 10–1 000 μg/L was obtained as follows y = 383 709.18x ? 4 686.41， with correlation coefficient of 0.998 3. The average recoveries of 2-DCB at three spiked concentration levels of 25， 100

and 400 μg/kg ranged from 78.2% to 105.5%， with relative standard deviation （RSD） lower than 7.3%. The detection limit and quantitation limit were 1.8 and 6.0 μg/kg， respectively. The method had the advantages of simple pretreatment， large-scale automated detection and high sensitivity.

Keywords： gel permeation chromatography; irradiated meat products; gas chromatography-tandem mass spectrometry; 2-dodecylcyclobutanone

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040

中图分类号：O657.6                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）04-0053-05

引文格式：

邵彪， 周小兰， 王琳琳， 等. 凝胶渗透色谱净化-气相色谱-串联质谱法检测辐照肉制品中2-十二烷基环丁酮[J]. 肉类研究， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040.    http：//www.rlyj.net.cn

SHAO Biao， ZHOU Xiaolan， WANG Linlin， et al. Detection of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated meat products by gel permeation chromatography followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040.    http：//www.rlyj.net.cn

食品辐照是以辐射技术为基础，运用X射线、γ射线或高速电子束等电离辐射产生的高能射线对食品进行加工处理的一种杀菌及保藏技术，能够起到杀虫、杀菌、抑制生理过程的作用，实现提高食品卫生质量、延长贮藏期的效果[1-3]。辐照技术属于冷加工技术，可以在常温或低温条件下进行，因此在食品加工领域具有巨大的应用价值[4-5]。然而，食品辐照过程中的能量传递会引发产生自由基以及一系列化学和生物效应，并伴随物质的降解和辐解副产物的生成[5-7]。因此，辐照食品存在一定的争议，一方面来自于辐照处理产生的未知副产物，存在潜在安全隐患;另一方面，食品固有的营养成分，如维生素、蛋白质等会遭到破坏或降解，降低其生理价值，影响食品品质[8-9]。根据各国多年的研究结果，低剂量辐照对食品成分变化的影响非常细微，联合国粮农组织/世界卫生组织/国际原子能机构组织的联合专家委员会于1980年10月宣布，吸收剂量10 kGy以下的任何辐照食品都是安全的，无需作毒理学实验[10]。多个国家依据10 kGy为剂量上限，为不同食品制定相应的辐照标准，允许辐照技术用于食品加工，但需要有辐射标识明示，并且不允许重复辐照。当前，辐照技术已广泛应用于脱水蔬菜、香辛料、谷物、水果、花粉、大蒜、畜禽肉、水产品、速溶茶等食品中。但是，在辐照加工领域，为追求更好的食品卫生质量，存在超剂量辐照、重复辐照等违法辐照乱象，带来一定的安全风险;同时，还有少部分辐照食品未按规定进行标识，侵害消费者知情权。因此，对于辐照食品，尤其是违法辐照食品的监测和甄别具有重要意义。

辐照食品的鉴别方法有很多，如针对辐解化学产物的色谱法和色谱-质谱联用法[11-14]、针对辐照产生自由基的电子自旋共振检测法[15-16]、基于发光现象的热释光法、光致发光法和化学发光法[17-19]以及基于辐照引起DNA变化的DNA彗星法和荧光定量聚合酶链式反应法[20-21]等。对辐照肉制品而言，由于肉制品所含的脂肪酸经辐照后能够形成标志性辐解产物2-十二烷基环丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB），因此被用于该类食品鉴别[22-23]。目前，2-DCB的分析方法包括气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附测定等[24-26]，

其中以GC-MS最为常用，现行的NY/T 2215—2012

《含脂辐照食品鉴定 气相色谱质谱分析 2-烷基环丁酮法》[27]和GB 21926—2016《食品安全国家标准 含脂类辐照食品鉴定 2-十二烷基环丁酮的气相色谱-质谱分析法》[28]

均采用该方法，前处理通过索氏抽提、硅胶层析柱净化、氮吹浓缩等步骤进行提取净化，过程较为繁琐。

凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是一种食品分析领域样品前处理净化的有效手段，其原理是根据分子质量大小实现不同化合物的分离，能够有效去除基质中的脂肪、蛋白质、色素、多糖等大分子成分[29]。GPC可以与定量浓缩装置在线联用，操作简单便捷且可实现自动化处理，同时色谱柱能够反复使用。

针对辐照肉制品中2-DCB的检测，本研究尝试以GPC进行净化处理，并利用具有更高灵敏度的气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）多反应监测（multi reaction monitoring，MRM）模式进行分析。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

肉制品（调味猪肉、猪软骨、鸡肉）购于当地市场，辐照样品委托南通市迈克尔辐照有限公司采用60Co γ射线处理。

2-DCB标准品（纯度≥95%） 美国Sigma-Aldrich公司;正己烷（纯度95%，色谱级）、环己烷（纯度≥99.8%）、乙酸乙酯（纯度≥99.8%，色谱级） 德国CNW公司;无水硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D GC-MS/MS仪 美国Agilent公司;Freestyle样品处理系统（含在线固相萃取/GPC/EVA定量浓缩装置） 德国LC-Tech公司;Milli-Q超纯水装置   美国Millipore公司;AL204/01电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;KQ 5200DE超声波仪 昆山市超声仪器有限公司;0.22 μm有机微孔滤膜 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

将样品粉碎，称取约20 g（精确至0.000 1 g），加入100 mL正己烷，超声提取30 min，10 000 r/min离心15 min，收集上清液，加入10 g无水硫酸钠静置10 min，过滤后用正己烷重新定容至100 mL，获得样品提取液。

1.3.2 GPC处理

样品提取液使用Freestyle样品处理系统进行GPC纯化。GPC条件：GPC色谱柱（32 cm×2.5 cm），填料为Bio-Beads SX3（200～400 目）;流动相：体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯;流速5.0 mL/min;进样量5.0 mL;紫外检测波长254 nm;弃去前15 min流出液，收集16～46 min流分，淋洗3 min。

1.3.3 在线浓缩

所收集的流分通过EVA在线浓缩装置分两步浓缩，温度参数：水加热温度40 ℃，锥底部温度42 ℃;第1步浓缩至5 mL，用2 mL流动相清洗2 次，真空度16 kPa;第2步浓缩至3 mL，用1 mL流动相清洗2 次，真空度18 kPa;氮吹至近干，用正己烷定容至1 mL，即得样品待测液。

1.3.4 GC-MS/MS测定条件

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;

载气：He;流速1 mL/min;进样口温度260 ℃;升温程序：100 ℃保持1 min;20 ℃/min升温至160 ℃;2 ℃/min升温至200 ℃;20 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min;进样体积1 μL;分流方式：不分流。

MS/MS条件：电子轰击离子源，离子源温度230 ℃;一级MS四极杆温度150 ℃，二级MS四极杆温度150 ℃;电离能量70 eV;分辨率1.2 u;溶剂延迟时间6 min;传输线温度280 ℃;碰撞气（N2）流量1.5 mL/min;淬灭气流量2.25 mL/min。

1.3.5 标准曲线、检出限及定量限测定

以正己烷为溶剂，将2-DCB配制成质量浓度2 mg/L

的标准溶液，并稀释成10、25、50、100、500、1 000 μg/L系列标准工作液，利用所确定的色谱条件和质谱参数进行分析，以标准溶液质量浓度为横坐标，对应的定量离子对峰面积为纵坐标，得出标准工作曲线方程。取不含2-DCB的基质样品，加入2-DCB标准溶液（添加量10 μg/kg），按照所建立的方法重复测定10 次，以结果标准偏差的3 倍计算方法检出限，以结果标准偏差的10 倍计算定量限。

1.3.6 回收率与精密度测定

在未经辐照肉制品（调味猪肉、猪软骨、鸡肉）中分别添加25、100、400 μg/kg 3 个水平的2-DCB标准溶液，利用所建立的方法进行分析，平行测定6 次，计算回收率与相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 结果计算

样品中2-DCB含量按下式计算。

式中：ρ、ρ0分别为根据标准曲线方程求得的样品待测液及未经辐照的空白对照样品中2-DCB质量浓度/（μg/L）;m为样品质量/g。

2 结果与分析

2.1 样品提取与净化处理

根据2-DCB的脂溶性特征，同时参照NY/T 2215—2012

和GB 21926—2016，选择正己烷作为提取溶剂。肉制品基质复杂，样品提取过程不可避免带来蛋白质、脂肪等杂质，不仅会对后续分析检测结果造成干扰，还会带来污染，影响仪器使用。2-DCB相对分子质量为238，采用GPC净化处理以去除肉制品基质中脂肪、蛋白质等大分子成分。结果表明，在本研究参数条件下，前16 min内大分子物质能够被有效去除，40 min内化合物被全部洗脱。为提高回收率同时避免不同样品基质带来的不确定性，在16～46 min收集色谱流分。此外，由于GPC净化对样品具有稀释效应，使用在线定量浓缩装置对净化后样品进行浓缩。

2.2 色谱条件与质谱参数优化

根据2-DCB的极性，选用弱极性的HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分析，在确定的色谱分析条件下，利用全扫描模式获得一级质谱图。

由图1可知，一级质谱图中丰度较高的离子为m/z 98.1、

m/z 112.2，分别以其作为母离子，通过设定不同碰撞电压进行碰撞，比较所获得离子对的丰度大小。选择丰度较高的4 对离子对作为MRM离子对进行监测。经过优化，确定2-DCB的MRM参数如表1所示。以丰度最高的离子对m/z 98.1>83.1作为定量离子对，其余离子对作为定性离子对。

2.3 标准曲线、检出限和定量限

利用GC-MS/MS的MRM模式分析2-DCB標准溶液，所得总离子流图和定量离子流图如图2所示。所得标准曲线方程为y=383 709.18x-4 686.41，相关系数为0.998 3，方法检出限和定量限分别为1.8、6.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

由表2可知，样品平均加标回收率为78.2%～105.5%，RSD为1.3%～7.3%，表明该方法准确度和精密度较高，能够较好地测定肉制品中2-DCB含量。

2.5 样品测定

利用本研究所建立的方法分析0、10、20 kGy辐照剂量下调味猪肉、猪软骨、鸡肉中2-DCB的含量，通过比较目标色谱峰与标准物质的保留时间及相应子离子丰度比进行定性，通过标准曲线方程计算2-DCB含量，20 kGy辐照剂量下样品离子流图如图3所示。

A～C. 分别为调味猪肉、猪软骨和鸡肉;

下标1～2. 分别为总离子流图和定量离子流图。

由表3可知，未经辐照样品中2-DCB均未检出，印证了其可作为含脂类辐照食品鉴别的化学标志物。对于同一样品，2-DCB含量与辐照剂量具有相关性，辐照剂量越大，2-DCB含量越高，因此，2-DCB含量可以用作超剂量辐照的判别依据。

3 结 论

采用GPC对样品进行净化处理，利用GC-MS/MS的MRM模式，建立辐照肉制品中2-DCB检测方法。基质样品加标回收实验和精密度实验结果证实了方法的可行性和准确性。本方法在前处理过程中，利用GPC与定量浓缩装置在线联用，实现自动批量处理，避免了现行标准中复杂的操作过程;在分析步骤中，采用GC-MS/MS的MRM模式进行分析，相较于GC-MS法具有较高灵敏度，同时，筛选出多对离子对进行监测，有利于更加准确地定性，避免假阳性结果。

[16] AHN J J， SHAHBAZ H M， AKRAM K， et al. Improved electron spin resonance spectroscopy with different sample treatments to identify irradiated sprout seeds[J]. Food Analytical Methods， 2014， 7（9）： 1874-1880. DOI：10.1007/s12161-014-9831-9.

[17] AHN J J， AKRAM K， BAEK J Y， et al. Identification of gamma-irradiated ingredients in liquid seasonings by thermoluminescence analysis： an interlaboratory blind trial[J]. European Food Research and Technology， 2013， 236（5）： 771-776. DOI：10.1007/s00217-013-1942-9.

[18] PAL S， KIM B K， KIM W Y， et al. Identification of γ-ray irradiated medicinal herbs using pulsed photostimulated luminescence， thermoluminescence， and electron spin resonance spectroscopy[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009， 394（7）： 1931-1945. DOI：10.1007/s00216-009-2877-7.

[19] HEIDE L， BOGEL W. Identification of irradiated spices with thermo- and chemiluminescence measurements[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2010， 22（2）： 93-103. DOI：10.1111/j.1365-2621.1987.tb00463.x.

[20] CETINKAYA N， ERCIN D， ?ZVATAN S， et al. Quantification of applied dose in irradiated citrus fruits by DNA comet assay together with image analysis[J]. Food Chemistry， 2016， 192（2）： 370-373. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.07.027.

[21] 劉绵学， 伏毅， 郑宇， 等. 荧光定量PCR辐照食品鉴定技术的优化研究[J]. 生物技术通报， 2018， 34（12）： 77-83. DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0481.

[22] 张海伟， 张雨露， 费晨， 等. 含脂食品辐照标志物2-烷基环丁酮检测技术研究进展[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2016， 34（4）： 11-18. DOI：10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.040102.

[23] ZHAO Yueliang， WANG Feng， LI Weiming， et al. 2-dodecylcyclobutanone as an irradiation dose indicator to identify and estimate original dose in irradiated ground beef[J]. European Food Research and Technology， 2012， 235（5）： 901-906. DOI：10.1007/s00217-012-1818-4.

[24] 张秀彤， 李安， 潘立刚， 等. 加速溶剂萃取-气相色谱-质谱法测定辐照猪肉中2-十二烷基环丁酮[J]. 食品安全质量检测学报， 2016， 7（3）： 1170-1175. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts. 2016.03.057.

[25] 蒋俊树， 朱峰， 聂磊. 液相色谱串联质谱法测定辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮的研究[J]. 安徽化工， 2012， 38（3）： 67-69; 71. DOI：10.3969/j.issn.1008-553X.2012.03.024.

[26] ZHAO Yueliang， HA Yiming， YUE Jiachang， et al. Development of a novel biosensor based on F0F1-ATPase for the detection of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated beef[J]. Food Chemistry， 2015， 188（2）： 320-324. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.04.142.

[27] 中国农业科学院农产品加工研究所， 农业部辐照产品质量监督检验测试中心. 含脂辐照食品鉴定 气相色谱质谱分析 2-烷基环丁

酮法： NY/T 2215—2012[S]. 北京： 中国标准出版社， 2012.

[28] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会， 国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准 含脂类辐照食品鉴定 2-十二烷基环丁酮的气相色谱-质谱分析法： GB 21926—2016[S]. 北京： 中国标准出版社， 2016.

[29] 苑欣娅， 姚晶， 陈彦凤， 等. 茶叶中农药残留检测前处理技术研究

进展[J]. 中国卫生检验杂志， 2019， 29（20）： 2555-2558.

[30] 郑建飞， 徐刚， 吴明红， 等. 辐照猪肉产生的2-十二烷基环丁酮剂量检测及其微波加热影响[J]. 核技术， 2009， 32（5）： 356-360.

收稿日期：2020-02-20

基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2015QK060）;

江苏省质量技术监督“352专业技术人才培养工程”资助项目;南通市“226高层次人才培养工程”资助项目

第一作者简介：邵彪（1983—）（ORCID： 0000-0001-8749-889X），男，高级工程师，博士，研究方向为食品质量与安全分析。

E-mail： shaobiao1983@sina.com

通信作者简介：陈刚（1967—）（ORCID： 0000-0002-1817-205X），男，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品质量与安全分析。E-mail： 1351292318@qq.com