朱 衡，张继福，张 云，胡云峰*

（1.中国科学院 南海海洋研究所/热带海洋生物资源与生态重点实验室/广东省海洋药物重点实验室，广东 广州510301；2.中国科学院大学，北京100049；3.广东省中医院，广东 广州510120）

【研究意义】脂肪酶作为重要的工业用酶，可以催化酯水解、酯交换、酯合成反应，在环境[1]、农业、食品、化妆品、能源[2]、化工合成[3-4]、生物传感器等行业均有应用[5-6]。Zhang等[7]制备的固定化脂肪酶可以催化生物柴油的制备，为生物能源的产业发展提供了新的方向。随着对脂肪酶的研究不断深入，微生物所产脂肪酶受到科研人员长期以来的关注，并且在诸多工业领域中有着极其广泛的应用。【前人研究进展】由于固定化载体的连接和保护，酶的天然构象可以得到稳定，可以抵挡催化环境酸碱和热对酶催化剂的攻击，固定化酶在稳定性等方面都会得到提高[8]。相比于游离酶，固定化酶最大的优势是可以重复利用和易分离，可以极大的降低工业酶的使用成本，因此固定化成为了脂肪酶等工业用酶产业应用的关键一步[9]。目前最普遍的吸附固定化方法存在一个很大的缺点，即由于其利用较弱的范德华力和分子间作用力吸附工业酶，研究者发现，利用该方法制备的固定化酶在反应过程中酶易脱离，造成酶的损失，同时污染了反应产物[10]。但是交联固定化则利用共价键等较强的作用力，可以牢固将酶与载体结合在一起，从而减少酶脱落的机率[11]。Mehdi等[12]对比了离子结合、共价结合与吸附固定化，发现共价结合所制备的固定化酶酶活更高。【本研究切入点】天然材料如甲壳素与壳聚糖，是利用虾蟹的壳提取和处理得到，两者具有一系列独特的特性：生物相容性、对无害产品的生物降解性、无毒性、生理惰性、抗菌性、重金属离子螯合性、凝胶形成性和亲水性，以及对蛋白质的显著亲和力[13]，这些特性使得甲壳素和壳聚糖成为固定化的优良载体。其中甲壳素是由N-乙酰α-氨基-D-葡萄糖胺以β（1→4）糖苷键连结而成的含氮多糖，经过脱酰后得到壳聚糖，但是甲壳素本身仍然含有一定量的氨基[14]。甲壳素相比于壳聚糖的稳定性更高，不易溶胀，甲壳素也是目前唯一天然的含有正电荷阳离子基团的可食性动物纤维[15-16]。【拟解决的关键问题】脂肪酶等工业酶在工业生产中的实际应用，仍存在些问题尚未解决，比如酶与底物分离问题和工业酶的重复使用性问题等[17-18]。由于人工合成树脂价格较为昂贵，会增大工业酶固定化过程的成本。在固定化过程使用壳聚糖或甲壳素，既可以高效利用这些蟹壳废弃物，又可以为固定化寻找到新的载体。本实验利用戊二醛的双醛基团处理甲壳素和壳聚糖，活化表面氨基后与酶的表面氨基反应，从而将脂肪酶固定到壳聚糖和甲壳素上，有研究[19]表明戊二醛交联是适用于壳聚糖和甲壳素载体制备固定化酶的最佳方法。筛选了市面上的5种甲壳素和9种壳聚糖，得到最佳固定化载体为来自ACMEC公司的甲壳素J3。利用单因素和正交实验优化了制备条件，并进行模拟工业扩大固定化过程后表明其具备工业生产的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

固定化材料：5种甲壳素（CAS：1398-61-4）和9种壳聚糖（CAS：9012-76-4），厂商来源见下表1；25%戊二醛：天津福晨化学试剂。

酶活测定材料：乳化液底物：橄榄油采购于上海麦克林试剂公司；聚乙烯醇采购于天津大茂化学试剂厂，利用实验用水配置4%的聚乙烯醇，按照比例聚乙烯醇∶橄榄油=3∶1，进行混合，超声功率40%，on：2 s，off：1 s，超声5 min两次，摇匀，4℃冰箱备用。浓盐酸购买于广东白云区良田光明化工厂；无水乙醇购买于广东光华科技股份有限公司；异辛烷采购于天津大茂化学试剂厂；无水醋酸铜、吡啶订购于上海麦克林试剂公司。

表1 甲壳素及壳聚糖厂商来源Tab.1 Manufacturer sources of chitin and chitosan

1.2方法

1.2.1 酶活测定方法 以乳化橄榄油为底物反应15 min，加入无水乙醇和盐酸终止酶反应，使底物乳液破乳，用异辛烷萃取生成的脂肪酸，并用醋酸铜显色，通过测定铜皂的吸光度来测定生成的脂肪酸的量而得到脂肪酶的活力[20-21]。

1.2.2 固定化优化方法（1）单因素实验。单因素实验作为后续条件优化的基础，以酶活为参考标准，针对固定化条件进行了全面的筛选，涉及载体的筛选、交联剂浓度、交联温度、交联时间、载体量、固定化温度、pH和固定化时间，各因素下进行3次重复实验确定最终结果。

①载体对固定化效果的影响。从5种甲壳素和9种壳聚糖中筛选最优载体，所使用的酶固定化条件为：载体1 g、pH 7.0、戊二醛0.5%、温度30℃、交联2 h、固定化3 h。在40℃，pH 7.0的环境下测定脂肪酶的酶活。

②固定化顺序对固定化效果的影响。针对筛选出的最优载体J3（ACMEC），尝试两种固定化顺序：交联后固定化和同时固定化，其余酶固定化和反应条件同上，进行酶活测定。

③交联剂浓度对固定化效果的影响。设定交联剂浓度为0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%，其余条件：J3（ACMEC）载体量1 g、温度30℃、酶液pH 7.0、交联2 h、固定化3 h进行单因素实验。

④交联温度对固定化效果的影响。设定交联温度25，30，35，40℃，其余条件：J3（ACMEC）载体量1 g、戊二醛1%、交联时间2 h、固定化时间3 h、pH 7.0、固定化温度30℃进行单因素实验。

⑤交联时间对固定化效果的影响。设定交联时间1，2，3，4，5 h，其余条件：J3（ACMEC）载体量1 g、戊二醛1%、交联温度25℃、固定化时间3 h、pH 7.0、固定化温度30℃进行单因素实验。

⑥载体量对固定化效果的影响。设定0.5，0.75，1，1.25，1.5 g载体量，其余条件：戊二醛1%、交联时间2 h、固定化时间3 h、交联温度30℃、pH 7.0、固定化温度30℃进行单因素实验。

⑦固定化温度对固定化效果的影响。设定固定化温度25，30，35，40℃。其他条件：1%戊二醛、交联温度30℃、交联时间2 h、J3（ACMEC）载体量0.75 g、pH 7.0、固定化时间3 h进行单因素实验。

⑧pH对固定化效果的影响。设定pH为5、6、7、8、9，其余条件：1%戊二醛、交联温度30℃、交联时间2 h、J3（ACMEC）载体量0.75 g、固定化时间3 h、固定化温度30℃进行单因素实验。

⑨固定化时间对固定化效果的影响。设置固定化时间：1，2，3，4，5 h；其余条件：戊二醛1%、交联时间2 h、交联温度30℃、J3（ACMEC）载体量0.75 g、固定化温度30℃进行单因素实验。

（2）正交实验。在单因素基础上进行正交实验，针对固定化温度、固定化时间、pH、载体量进行正交实验设计，见下表2。并利用MINITAB 17软件进行数据分析确定最佳条件。

表2 正交实验设计Tab.2 Orthogonal experimental design

（3）最佳条件下进行扩大固定化。在最佳条件下进行20倍扩大固定化，以模拟实际工业级制备固定化酶的过程，从效果来看，扩大固定化酶的酶活并没有变化，均在170 U/g左右，说明可以进行工业制备的可能。

1.2.3 酶学性质表征（1）最适反应pH。按照最适固定化条件制备的固定化酶与pH 7.0的游离酶，在40℃反应温度下，在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液环境中进行酶活测定，重复3次并进行比较。

（2）最适反应温度。按照最适固定化条件制备的固定化酶与pH 7.0的游离酶，在以上确定出的最适反应pH下，在不同温度（35，40，45，50，55，60℃）环境中进行酶活测定，重复3次并进行比较。

（3）热稳定性。按照最适固定化条件制备的固定化酶与pH 7.0的游离酶，采用不同温度（40，50，60，70℃）水浴环境中孵育3 h后，在以上确定出的最适反应条件下进行酶活测定；重复3次并进行比较。

（4）酸碱耐受性。按照最适固定化条件制备的固定化酶：在不同pH（5、6、7、8、9）磷酸缓冲液环境中浸泡3 h；游离酶：利用不同pH磷酸缓冲液配置酶液，静置3 h，在以上确定出的最适反应条件下进行酶活测定；重复3次并进行比较。

（5）重复使用性。按照最适固定化条件制备的固定化酶在相同的底物环境中重复进行催化底物水解反应，以第一次的酶活为100%，重复使用6次观察固定化酶重复使用性。

（6）储存稳定性。按照最适固定化条件制备的固定化酶分装成0.1 g/1.5 mL EP管，在4℃环境中保存一个月，每隔5d测定当天的酶活，观察一个月内的酶活变化趋势。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

由图1a可知，在实验条件下，基于编号J3的甲壳素制备的固定化酶的酶活最高，因此后续选用J3进行单因素实验。由图1b可知，先交联后固定化获得的固定化酶的酶活要高于同时交联固定化获得的固定化酶的酶活，同时为了减轻交联剂戊二醛对酶的毒害作用，选择先交联后固定化的方法进行脂肪酶的固定化。由图1c可知，戊二醛的浓度对固定化酶的酶活也有较大的影响，酶活随着交联剂浓度的升高先升后降，在戊二醛的浓度为1%时有最高酶活，因此选取1%的戊二醛浓度进行后续的单因素实验。由图1d可知，在选定的温度范围中，固定化酶的酶活随着温度升高呈先升后降的趋势，在30℃时固定化酶的酶活达到最佳酶活，因此选取30℃进行后续的单因素实验。由图1e可知，在选区的反应时间范围内，酶活在反应2 h时有最佳酶活，因此选取2 h进行后续的单因素实验。由图1f可知，在选取的载体量范围内，固定化酶酶活在载体量为0.75 g达到最佳酶活，因此后续选取0.75 g载体量进行后续的单因素实验。由图1g可知，在选取的反应温度范围内，固定化酶在30℃表现出最佳酶活，因此设定30℃固定化温度进行后继的单因素实验。由图1h可知，随着反应pH的升高，固定化酶的酶活呈现下降趋势，因此设定pH 5.0进行后续的单因素实验。由图1i可知，随着反应时间的延长，固定化酶的酶活呈现先升后降趋势，选取2 h为最佳固定化时间。

2.2 正交实验

在单因素实验基础上，对固定化条件：pH、固定化时间、载体量、固定化温度进行正交实验。在MINITAB 17软件的帮助下，对正交实验进行了设计和分析。重复3次实验，所测得结果见下表3，并利用MINITAB17对结果进行回归分析，得到回归方程为：

y=247.8+6.66A-8.26 B-19.45C-10.85D

表3 正交实验结果Tab.3 Results of orthogonal experiment

方差分析见表4，由P（C：载体量）＜0.05，可以判定载体量是对固定化效果影响最为显著的因素。均值响应表数据分析见表5，均值效应图见图2。通过数据分析可知影响因素由大到小依次为：载体、温度、固定化时间和pH；最佳固定化条件为：A2B1C1D1即：pH 5.0、固定化1 h、载体0.5 g、固定化温度25℃，在此条件下制备的固定化酶酶活达到170 U/g左右。

2.3 扩大固定化

在最佳条件下，进行20倍扩大固定化，在载体为10 g的条件下，所制备的固定化酶相比于未扩大的固定化酶并没有较大差别的酶活改变，皆为170 U/g左右。因此该方法是具有工业化制备的潜力。

2.4 酶学性质表征

2.4.1 最适反应pH 由图3a可知，固定化酶的最适反应pH为8.0，游离酶最适pH是7.0中性，固定化后在酶和载体间形成的连接键导致酶表面的电荷团发生改变，会引起固定化酶表面的离子状态发生改变，聚集大量阴离子，因此会更偏向于碱性环境进行催化。

图1 单因素实验结果Fig.1 Results of single-factor experiments

表4 正交试验结果方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal experiment

图2 均值相应图Fig.2 corresponding graph of mean value

表5 均值响应表Tab.5 Mean response table

2.4.2 最适反应温度 由图3b可知，固定化酶最适反应温度为40℃，游离酶同样也是40℃，甲壳素为天然材料，固定化酶保持了天然酶的原有构象，因此载体的连接没有影响到酶的最适反应温度。

2.4.3 酸碱耐受性 由图3c可知，固定化酶与游离酶的酸碱适应性正好相反，游离酶喜好碱性环境，而固定化酶更喜欢酸性环境，在pH 9.0时，其残余酶活仅剩余50%。这和最适反应条件不同，因为短时间的反应对酶的微环境影响不大，但是较长时间浸泡则会对固定化酶的结构以及表面离子和电荷的排布造成破坏，因此碱性环境会对固定化酶的酶活有较为严重的影响。

2.4.4 热稳定性 由图3d可知，固定化酶相比于游离酶的温度耐受性在更高温度下才能显示出来，虽然在50、60℃下降幅度较大，但是60～70℃，酶活下降平缓，维持在50%左右，在70℃下3 h,相比于游离酶仅剩余30%初始酶活，固定化酶J3的残留酶活更高，这也显示出该固定化酶的耐热性还是较好的。连接上载体后，增加了酶的分子量，同时酶分子对于热的耐受性更加强，可能是因为载体稳固了酶的活性构象，使其不会较大损伤。

2.4.5 重复使用性 重复使用性是衡量固定化酶好坏和是否能够进行工业化制备的重要标准，由图3e可知，该固定化酶J3在重复使用6次时残留50%左右的酶活，而游离酶是无法回收重复使用的。同时，实验室条件下测定重复性，固液无法100%分离，在每次使用后会由于碰撞等原因会损失掉一部分固定化酶，因此会导致酶活的降低，因此若在每次使用后再补加适量的固定化酶，相信对于酶活的保持有更为明显的影响。

2.4.6 保存稳定性 由图3f可知，该固定化酶在4℃下保存30d，其酶活仍有50%，而且在第5天酶活是下降最明显的，可能因为刚制备完成，固定化酶中会残余一些水分，水分的存在会影响固定化酶的保存；另外也可能是由于载体上残余的戊二醛会对脂肪酶的活性有较大的影响，可能需要通过将制备好的固定化脂肪酶在氨基酸等溶液中孵育以去除载体中残余的戊二醛等有害交联剂[22]。

图3 固定化脂肪酶J3与游离脂肪酶的酶学性质比较Fig.3 Comparison of the enzymatic properties of immobilized LIPASE J3-LIPASE and free lipase

3 结论与讨论

本实验从14种载体（5种甲壳素，9种壳聚糖）中筛选出最适合海洋脂肪酶固定化的甲壳素载体J3（ACMEC），经过单因素和正交实验确定了其最佳固定化条件：戊二醛1%，交联温度30℃，交联时间2 h、pH 5.0、固定化1 h、载体0.5 g、固定化温度25℃，同时发现载体量对酶活影响最显著。将载体量扩大20倍后发现，该固定化酶J3的酶活达到（170±10）U/g，与未扩大之前并无显著差别，说明该方法具备工业应用的潜力。该固定化酶在重复使用性方面的表现最佳，使用6次剩余50%的酶活，羧基载体与EDC交联得到的固定化酶，使用6次酶活仅剩余40%，氨基载体LX-1000HA交联戊二醛固定化脂肪酶使用6次酶活剩余40%[23]，短链氨基载体LX-1000EA交联聚乙二醇二缩水甘油醚得到的固定化酶使用6次剩余20%酶活[24]。由此可见：使用同一种海洋假丝酵母脂肪酶进行交联固定化，与氨基和羧基合成载体相比，甲壳素作为交联固定化的载体，在重复利用性方面的表现最为优异，对于催化过程中酶活的丢失较少，能够保留较高的初始活性。

甲壳素和壳聚糖作为天然高分子载体材料，其独有的特点是成本低廉，环境友好且安全，但是作为生物材料，同样也凸显了缺点，特别是壳聚糖载体较容易受到环境温度和酸碱变化的影响，影响到固定化酶的催化活性。但是，相比于周蕊等[25]制备的Chitosan-GA固定化酶循环使用4次仅保留了20%左右的初始酶活力，本研究获得的固定化酶J3具有较好的连续使用性；相比于邱玉龙等[26]利用的壳聚糖微球耗时9h进行固定化脂肪酶，本方法更加经济便捷。

该固定化酶在模拟工业制备实验中，发现在最佳制备条件下将载体量扩大20倍，所得固定化酶的酶活并没有下降，而且固定化后的游离酶液可以回收利用，用于后续固定化；同时甲壳素载体的成本较低，可以更大程度地降低生产投入，进一步说明该固定化方法具有实际开发的潜力。