周美，万科，马风伟，王瑜，李春燕，梁光焰，宋智琴，潘卫东，王道平，*

（1.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳550014；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550014；3.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005；4.贵州省农业科学院现代中药材研究所，贵州贵阳550006）

据报道，自由基会引发多种疾病[1]，如心血管疾病、衰老、癌症等，抗氧化剂能在一定程度上清除自由基，降低人体衰老的速度，预防疾病；同样，免疫力低下会增大细菌病毒对人体的侵袭，严重威胁到人体的健康，免疫调节剂能有效调节机体免疫功能。因此，亟需开发出安全、高效的抗氧化剂和免疫调节剂。

白及为兰科植物白及 Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥块茎，多年生草本，主产于贵州、四川、湖南、安徽等地。白及中主要含有多糖类、萜类、菲类、联苄类等化学成分[2-3]。植物多糖具有较好的生物学活性，能有效清除自由基，促进机体健康、益寿延年[4-5]；同时也具有较强的免疫调节作用，能提高巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体生成[6]；提高淋巴细胞转化率和NK细胞的活性，增强机体抵抗力[7]。白及多糖是白及的主要活性成分，具有安全、毒副作用小等优点，是一种值得深入研究的天然活性物质。酶解法提取植物多糖是一种新兴的提取方法，由于其提取效率高、便捷、节省能源，目前被广泛使用。白及药用部位为块茎，果胶是其细胞壁的主要成分之一，果胶酶能对其细胞壁进行降解，多糖类成分能更有效溶出，多糖提取率增加。本试验运用响应面法对白及多糖的酶解工艺进行优化，并对白及多糖的抗氧化活性、免疫活性进行系统考察，以期为相关食品和医药的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白及：贵州省农科院农作物品种资源研究所。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：日本株式会社公司；DMEM 培养基、胎牛血清、小鼠TNF-α、酶联免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：美国 Sigma公司；小鼠巨噬细胞系RAW264.7：上海细胞库；脂多糖、二甲基亚砜、磷酸氢二钠、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、三氯乙酸、水杨酸：国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯；维生素C、D-无水葡萄糖：中国食品药品检定研究院；果胶酶（5000 U/g）：伯奥生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPECTRA max PLUS 384光吸收酶标仪：美国分子仪器公司 Molecular Devices；HP-8453紫外可见分光光度计：美国HP公司；AG285型十万分之一天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；SB-2000型水浴锅：上海爱朗仪器有限公司；HC-2066型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；BSC-150恒温恒湿培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；密理博明澈TM-D 24UV纯水/超纯水系统：德国默克公司；酶联免疫检测仪、水套式CO2培养箱：美国热电公司；倒置显微镜：日本尼康公司。

1.3 试验方法

1.3.1 白及多糖酶解试验方法与设计

1.3.1.1 单因素试验

通过前期白及多糖提取方式对比发现，果胶酶酶解优于煎煮，因此，提取方式选择果胶酶酶解。多糖提取率按硫酸-苯酚法检测[8]。在液料比设定为100∶1（mL/g）的条件下，依次考察酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH值影响白及多糖提取率的程度。以葡萄糖作标准曲线，所得多糖提取液分别按硫酸-苯酚法计算提取率。

1）酶添加量的考察

固定其他提取条件，以酶添加量为单因素变量，分别考察酶添加量为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%对白及多糖提取率的影响。

2）酶解温度的考察

固定其他提取条件，以酶解温度为单因素变量，分别考察酶解温度为 40、45、50、55、60、65 ℃对白及多糖提取率的影响。

3）酶解时间的考察

固定其他提取条件，以酶解时间为单因素变量，分别考察酶解时间为 55、70、85、100、115 min 对白及多糖提取率的影响。

4）pH值的考察

固定其他提取条件，以pH值为单因素变量，分别考察 pH 值为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 对提取率的影响。

1.3.1.2 响应面试验设计

通过对单因素的系统考察，以酶添加量（A）、pH值（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为自变量，以白及多糖提取率为响应值。运用Design Expert V8.0.6软件进行四因素三水平试验设计，白及多糖的提取工艺因素水平表见表1。

表1 白及多糖的提取工艺因素水平表Table 1 The factor level table of extraction technology of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.polysaccharides

1.3.2 白及多糖的抗氧化活性试验

精密称取白及多糖适量，置10 mL容量瓶中，用纯水溶解、定容，再稀释为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL不同浓度的溶液。VC对照品溶液的制备：精密称取VC对照品适量，置10 mL容量瓶中，用纯水溶解、定容，再稀释为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的对照品溶液。

1.3.2.1 DPPH·清除能力的测定

在15 mL具塞试管中分别加入2 mL不同浓度供试液，分别加入1 mL纯水、2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合均匀后，于25℃条件下避光反应40 min，在517 nm处测吸光度值（Am）。在同等条件下，以2 mL蒸馏水代替DPPH溶液，测得吸光度值为（A1）；以2 mL纯水代替供试液，测得吸光度值为（A0）；阳性对照为VC。计算公式如下[10]：

DPPH 自由基清除力/%=[A0－（Am－A1）]/A0×100

1.3.2.2 ·OH清除能力的测定

在15 mL具塞试管中分别加入1 mL不同浓度供试液，再分别加入8 mmol/L硫酸亚铁溶液、8 mmol/L双氧水溶液、蒸馏水、10 mmol/L水杨酸、无水乙醇各1 mL，混合均匀后，于37℃条件下水浴30 min。于510 nm处测定吸光度值（Am）。在同等条件下，以1 mL蒸馏水代替水杨酸溶液，测得吸光度值为（A1）；以1 mL蒸馏水代替样品液，测得吸光度值为（A0）；阳性对照为VC。清除率公式如下[11]：

·OH 自由基清除力/%=[A0－（Am－A1）]/A0×100

1.3.2.3 ABTS+·清除能力的测定

精密称取ABTS+·和K2S2O7适量置同一个1000mL的容量瓶中，加无水乙醇配制成浓度为7 mmol/L ABTS+·和2.45 mmol/L K2S2O7混合溶液，放置过夜，即得ABTS+·储备液。临用时用无水乙醇将储备液稀释成在734 nm处吸光度值为（0.70±0.05）的溶液。分别取2 mL各浓度供试液和2 mL ABTS+·溶液充分混合并放置20 min，于734 nm处测吸光度值ASample，在相同条件下，2 mL ABTS+·溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度值为AControl。阳性对照为VC。清除率公式如下[12-13]：

ABTS+自由基清除力/%=[（AControl－ASample）/AControl]×100

1.3.3 白及多糖的免疫活性

1.3.3.1 RAW264.7细胞培养

精密称取白及多糖适量，置25 mL容量瓶中，用纯水溶解、定容，再稀释成 25、100、400 μg/mL 3 个浓度供试液；试验组为不同浓度白及多糖组；空白组为DMEM 培养基组（BC）；对照组为 1 μg/mL LPS组（PC）。

RAW264.7细胞，加入10%胎牛血清、1 mL胰酶（0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA）的90%DMEM培养基，37℃条下在CO2的细胞培养箱中传代培养。

1.3.3.2 MTT法检测各浓度白及多糖对细胞存活率的影响

采用MTT法[14]测定细胞存活率。选取对数生长期RAW 264.7 细胞，按 1×106个/mL、100 μL/孔接种于96孔板中，37℃条下在CO2的细胞培养箱培养过夜，弃去上清，加入不同浓度白及多糖溶液各100 μL继续培养24 h，弃去上清，每孔加入MTT溶液100 μL，继续孵育3 h，然后每孔加入MTT终止液100 μL，再继续培养20 h，在550 nm处测定OD值，重复试验3次，计算细胞的相对存活率。

相对细胞存活率/%=（ASample-ABlank）/（AControl-ABlank）×100

式中：ASample为试验组吸光值；ABlank为空白组吸光值；AControl为空白组吸光值

1.3.3.3 白及多糖诱导RAW264.7细胞活化释放免疫因子TNF-α

将密度为1×106个/mL细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，37℃条下在CO2细胞培养箱中培养过夜，弃去上清，分别加入100 μL不同浓度供试液、纯水、LPS溶液继续培养24 h。按ELISA检测试剂盒操作方法对TNF-α进行定量测定，求出细胞因子TNF-α的分泌量。

1.4 数据处理

所有试验数据均为3次重复试验结果的平均值。采用Design Expert V8.0.6以及SPSS22.0等软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

酶添加量对白及多糖提取率的影响见图1。

图1 酶添加量对白及多糖提取率的影响Fig.1 The effect of enzyme addition on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如图1所示，白及多糖提取率整体上与酶添加量呈正相关，但在酶添加量为1.2%以后白及多糖提取率上升缓慢，造成这种现象的原因是随着酶的不断加入会使更多的底物在同一时间被分解得更充分，但当超过底物的接纳程度后便达到饱和，此时再添加多余的酶对提取的影响并不明显。所以酶添加量定为1.2%。

酶解温度对白及多糖提取率的影响见图2。

如图2所示，白及多糖提取率随温度升高有先上升后缓慢下降趋势，55℃时提取率最大，这是由于酶发挥其活性需要一个最适温度，当超过此温度后，酶结构会慢慢变性等，从而使酶解程度降低，所以选择55℃为酶解温度。

酶解时间对白及多糖提取率的影响见图3。

图2 酶解温度对白及多糖提取率的影响Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

图3 酶解时间对白及多糖提取率的影响Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如图3所示，白及多糖提取率随酶解时间延长而呈上升趋势，在85 min以后增加缓慢，可能是因为细胞壁被充分分解后，胞内物质的溶出便趋于稳定，而多糖得率的微弱降低可能是酶对多糖分子产生了轻微的降解，因此酶解时间选择85 min。

pH值对白及多糖提取率的影响见图4。

图4 pH值对白及多糖提取率的影响Fig.4 The effect of pH on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如图4所示，白及多糖提取率随pH值增大呈先上升后降低的趋势，pH5.5时提取率最高，表明酶的活性存在一个最佳的pH值，越接近此值，酶的活性越高，所以选择pH5.5。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，运用响应面-星点设计法优化白及多糖提取率的试验结果见表2和表3。其中表2为星点设计试验和结果；表3为多糖优化工艺所建立的回归方程的方差分析。

表2 响应面设计试验与结果Table 2 The central composite design and test results

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

续表3 回归方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression equation

通过多元线性回归二项式拟合，得方程为Y=+59.50+2.99A-0.11B-4.83C+0.17D-1.80AB+2.83AC+1.35AD+0.35BC+2.16BD+1.32CD-4.36A2-7.34B2-13.69C2-3.89D2，方程R2=0.920 3，说明该模型能够较好地预测白及多糖的酶解工艺。软件预测最佳提取条件为：酶添加量为1.40%、温度为54.71℃、pH值为5.43、时间为87.54 min，白及多糖多糖提取率预测值为58.29%。

方差分析结果表明，方程模型P＜0.000 1，极显著，失拟项15.64＞0.05，不显著，说明建立的模型能很好地预测白及多糖提取率，实际试验与预测值差异较小，拟合程度好。一次项A、二次项D2显著，二次项C2极显著，一次项C和二次项A2、B2高度显著。从F值可知，各因素对多糖提取的影响程度为：酶解温度＞酶添加量＞pH值＞酶解时间。

2.3 响应面分析

各因素对白及多糖提取率的交互作用结果见图5。

由图5b、5c和5f可知，曲面弯曲程度较大，说明酶解温度、酶添加量、pH值的交互作用对白及多糖提取率的影响较大。

2.4 验证试验

基于响应面法优选的白及多糖最佳酶解工艺，结合实施的便利，将优化条件修正为酶添加量为1.4%，温度为54.7℃，时间为87.5 min，pH值为5.4，试验重复5次，得到白及多糖提取率平均值为58.32%，和预测值非常接近。

图5 两因素的交互作用对白及多糖提取率的响应面图Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.production

2.5 抗氧化试验结果

白及多糖DPPH自由基清除率见图6。

图6 白及多糖DPPH自由基清除率Fig.6 The effect of scavenging DPPH free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由图6可知，白及多糖对DPPH自由基有一定的清除作用，在检测浓度范围内，随着供试液浓度的增加清除率逐渐增强，在浓度为3.2 mg/mL时，其DPPH·清除率高达43.6%。

白及多糖·OH清除率见图7。

图7 白及多糖·OH清除率Fig.7 The effect of scavenging hydroxyl free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由图7可知，白及多糖对·OH有一定的清除作用，在检测浓度范围内，随着供试液浓度的增加清除率逐渐增强，在1.6 mg/mL后清除率增加缓慢，在浓度为3.2 mg/mL时，其OH自由基清除率高达74.8%。

白及多糖ABTS+·清除率见图8。

图8 白及多糖ABTS+·清除率Fig.8 The effect of scavenging ABTS+free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由图8可知，白及多糖对ABTS+自由基有一定的清除作用，在检测浓度范围内，随着供试液浓度的增加清除率逐渐增强，在1.6 mg/mL后清除率增加缓慢，在浓度为3.2 mg/mL时，其ABTS+自由基清除率高达51.7%。

2.6 不同浓度白及多糖的体外免疫诱导活性结果

不同浓度白及多糖对RAW 264.7细胞的存活率影响见图9。

图9 不同浓度白及多糖对RAW 264.7细胞的存活率影响Fig.9 The effects of different concentrations of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.on RAW 264.7 cells

由图9可知，在所测定的浓度范围内，不同浓度供试液对细胞的生长具有一定的促进作用，细胞存活率均高于100%。

不同浓度白及多糖诱导RAW 264.7细胞分泌TNF-α的水平见图10。

不同浓度供试液分别孵育 24、36、48 h后诱导RAW264.7细胞活化分泌TNF-α的结果。在所测定的浓度范围内，不同时间段的酶解产物能显著诱导RAW264.7细胞活化分泌TNF-α。白及多糖浓度为400 μg/mL诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的作用最强。

图10 不同浓度白及多糖诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的水平Fig.10 Different concentrations of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.induced TNF-α secretion in RAW 264.7 cells

3 结论

本试验在单因素的基础上，利用响应面法优化白及多糖酶解工艺，方差分析结果表明，影响白及多糖提取率的因素主次顺序为：酶解温度＞酶添加量＞pH值＞酶解时间。最佳提取条件为：酶添加量为1.4%、温度为54.7℃、pH值为5.4、时间为87.5 min，白及多糖提取率预测值为58.32%。不同模型抗氧化活性试验结果表明，白及多糖具有较好的抗氧化活性。体外免疫诱导活性结果表明，不同浓度白及多糖对Raw264.7细胞生长有一定的促进作用，而且均可对Raw264.7细胞产生免疫调节活性，其中浓度为400 μg/mL时免疫诱导活性效果显著。本研究为白及多糖的深度开发利用奠定科学基础。