秦 燕，杨 光

(1.成都体育学院附属体育医院，成都 610000；2.四川省骨科医院，成都 610000)

脊髓缺血再灌注损伤(spinal ischemia reperfusion injury，SCIRI)在脊柱外科手术、血管畸形手术、胸主动脉瘤切除手术以及心脏手术体外循环期间中较为常见，具有潜在致残、致死性[1]。SCIRI的发病机制尚不明确，但研究表明[2]氧化应激中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量蓄积导致的细胞凋亡，以及血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)结构的破坏是SCIRI的最重要的病理改变[3]。因此寻找有效的药物或者治疗手段降低SCIRI后细胞内的ROS含量，降低细胞的凋亡率，以及保护BSCB的完整性是当前脊髓损伤防治与再生修复中研究的热点。右美托咪定是一种高选择性的肾上腺受体激动剂。药理研究表明[4]右美托咪定具有优良的镇静、抗焦虑和镇痛的作用。研究证实[5]右美托咪定能够在SCIRI中发挥抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptoR-4，CXCR4)/粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信号是重要的内源性的氧化应激信号通路之一[6]。王丽萍等[7]研究表明CXCR4-FAK信号能促进骨髓间充质干细胞向大鼠SCIRI组织的迁移，增强其粘附能力，降低氧化应激，减少ROS的集聚，发挥对大鼠脊髓的保护作用。因此本研究构建大鼠SCIRI模型，探讨右美托咪定通过CXCR4-FAK信号通路的调节对大鼠SCIRI的保护作用，从而为临床提供新的数据支撑。

1 材料和方法

1.1 实验动物

10～12周龄的SPF级SD雄性大鼠共计60只，体重在220～250 g，由我院实验动物实验中心提供[SCXK(川)2018-211]；所有动物均在四川省实验动物专委会养殖场SPF级动物房饲养[SYXK(川)2018-14]，室温下标准饲料、自由饮水、分笼(4笼)适应性饲养1周后用于试验。动物的使用及实验操作按照本院实验动物管理委员会(IACUC-JY-2018-075)的规定执行。实验过程中依照3R原则给予所有动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

盐酸右美托咪定注射液(dexmedetomidine hydrochloride injection，DHI，江苏恒瑞医药股份有限公司，生产批号为:国药准字H20090248)；CXCR4激动剂Diprotin A(美国cell signal公司，批号∶A13074)。

伊文思蓝(evans blue，EB)采购自Sigma公司，生产批号∶BCBL1305 V；TUNNEL试剂盒、DCFH-DA试剂盒购自美国Selleck公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、DAB化学发光试剂盒采购自天津百浩鑫生物有限公司；CXCR4、p-FAK抗体采购自Santa公司；戊巴比妥钠(德国进口分装，250 g/瓶)、多聚甲醛(批号∶050406)、二甲苯(批号83090501)采购自美国PALL公司；冰冻切片包埋剂采购自美国樱花公司；Western blot试剂盒购自美国abcam公司。

苏净Airtech超净工作台(北京六一仪器厂)；显微镊(型号∶15 cm 15 m/m)、显微剪(型号∶Ⅲ14 cm)(浙江宁波医用缝针厂)；Titan G2 60-300电镜(美 国FEI公司)；组织包埋机(型号∶LEICAEG1150)(德国Leica公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜(型号∶H-7650)(日本三菱公司)；5810R型高速离心机(日本岛津公司)；E-Gel Imager凝胶成像仪(美国Beckma公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型构建和分组处理

将60只10～12周龄的SPF级SD雄性大鼠随机分为4组(n＝15):假手术组(sham组)、模型组、右美托咪定组(DHI组)、CXCR4-FAK信号通路激动剂Diprotin A组(DPA组)。参照文献制作大鼠SCIRI模型[8]:大鼠注射麻醉后，常规备皮、消毒，取右侧卧位，固定在手术台上，在肋缘行纵切口，在显微镜下使用显微剪逐层分离，直至完全暴露大鼠左肺上叶，医用无菌纱布将肺部保护后，从心包处开始分离胸主动脉，使用无创动脉夹在主动脉弓锁骨上左动脉起始点处加闭15 min后，移除动脉夹，sham组不做加闭处理，常规无菌逐层缝合伤口，为防止感染术后需要尾静脉注射0.2 mL氨苄青霉素(100 mg/mL)。构建动物模型成功后，每只大鼠单笼饲养，常规饲料，标准饮食喂养。DHI组、DPA组大鼠在造模前72 h鞘内分别注射DHI和Diprotin A，注射剂量30μL，浓度5μmol/L，sham组、模型组注射等量生理盐水，每日定点注射1次，连续3 d。

1.3.2 各组大鼠下肢的神经运动功能评分

造模后第4天，采用改良的Tarlov评分方法评价各组大鼠下肢的运动功能[9]，评分标准为:0分:几乎没有可觉察额下肢活动；1分:大鼠有能被觉察的下肢关节自主活动；2分:大鼠的后肢能自由活动，但不能站立；3分:大鼠能站立，但不能行走；4分:大鼠后肢运动功能基本恢复，能正常行走。

1.3.3 伊文思蓝(evans blue，EB)染色检测各组大鼠BSCB的完整性

神经运动功能评价完毕后，在5 min内，尾静脉匀速注射50 mL EB(10 mL/kg)。1 h后处死大鼠，常规无菌手段剥离大鼠的脊髓组织，并迅速转移至深冷冰箱中。取大鼠的L4脊髓节段，采用4%多聚甲醛固定、15%、20%、30%蔗糖溶液沉糖，冰冻切片，在Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜下，每个切片选择6个视野观察BSCB的完整性并进行统计分析。

1.3.4 干湿法检测各组大鼠脊髓的含水量

取出大鼠的L5脊髓节段，首先用滤纸吸干脊髓表明水分，称取湿重(W)，放入恒温烤箱中24 h，烤箱温度维持在120℃，之后称取干重(D)。大鼠脊髓含水量(%)＝(W-D)/D×100%。

1.3.5 电镜观察各组大鼠脊髓组织超微结构改变

取出大鼠的10% L6脊髓节段，制成超薄组织切片:采用2.5%聚甲醛预固定15 min，1%锇酸固定20 min，无菌滤纸吸干水分，环氧树脂(812)浸透包埋切片，以醋酸双氧铀(uranyl acetate)及枸橼酸铅(lead citrate)做双重染色，制成50 nm切片，待切片完全干燥后载与铜网上，上透射电镜观察大鼠脊髓组织超微病理结构。

1.3.6 TUNEL染色检测各组大鼠脊髓组织中的细胞凋亡

从冰箱中取出10% L6脊髓节段，常规方法固定，冰冻切片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗5 min，风干后3%双氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃预冷乙醇上进行如下操作:0.1% TRItonX-100、0.1%缓冲液处理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应1 h，温度37℃，PBS漂洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，荧光显微镜进行观察，每组切片6个不同的视野，并通过Image-Pro 6.2软件处理图像，统计分析大鼠脊髓组织细胞的凋亡率。

1.3.7 各组大鼠脊髓组织的氧化应激比较

取大鼠的20% L6脊髓节段，10%聚甲醛固定2 h，石蜡包埋并切片，用10μmol/L DCFH-DA染色2 h，荧光显微镜下拍照。按照各试剂盒说明书要求，使用MDA检测试剂盒和SOD检测试剂盒来检测腹动脉组织中与氧化反应相关的底物变化水平。

1.3.8 Western blot检测各组大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK的表达

取出大鼠的20% L6脊髓节段，研磨匀浆，加入100 mL RIPA裂解液，冰上超声处理30 min后，离心获得上清，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，每个样品取50μg，然后进行SDS-PAGE电泳、转膜、加入封闭液4℃过夜孕育，然后分别加入一抗(1∶1500)，孕育1 h，洗涤加入抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶10000)，DAB显色，以GAPDH作为内参分析蛋白相对表达水平；每个样品独立重复3次。

1.4 统计学方法

数据分析采用软件SPSS 16.0，符合正态分布的计量资料采用平均数±标准差(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两组间的比较采用独立t检验，当P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经运动功能评分以及脊髓组织的含水量

如图1所示，与sham组相比，模型组大鼠神经运动功能评分明显降低(P＜0.05)，经药物干预后，与模型组相比，DHI组、DPA组大鼠神经运动功能评分明显升高(P＜0.05)，DHI组和DPA组相比，差异不明显(P＞0.05)，无统计意义。

如图2所示，与sham组相比，模型组大鼠的脊髓组织的含水量明显升高(P＜0.05)，经药物干预后，与模型组相比，DHI组、DPA组大鼠的脊髓组织的含水量明显降低(P＜0.05)，DHI组和DPA组相比，差异不明显(P＞0.05)，无统计意义。

2.2 EB染色检测各组大鼠BSCB的完整性

注射伊文思蓝(evans blue，EB)入血后能与白蛋白特异性结合，形成稳定的EB-白蛋白复合物。正常情况下，此复合物不能通过动物的血-脑和血-脊髓屏障，但是在血-脑和血-脊髓屏障结构被破坏后，才能渗出到神经组织中[10]，在荧光显微镜下，EB呈现鲜亮的红色。本研究中EB染色结果如图3所示，sham组大鼠未见红色荧光，表明BSCB结构完整；与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织经EB染色后，可见红色荧光强度明显增强(P＜0.05)，并且主要位于脊髓灰质，说明模型组中BSCB结构的完整性已被破坏，白蛋白大量渗出；，与模型组相比，DHI、DPA组大鼠脊髓组织EB荧光强度明显减弱(P＜0.05)，说明DHI、DPA组中BSCB结构的损伤有所恢复；DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

注:A:sham组；B:模型组；C:DHI组；D:DPA组。与sham组相比，*P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05。下图同。图1 各组大鼠神经运动功能评分(n＝10)Note.A，sham group.B，model group.C，DHI group.D，DPA group.Compared with sham group，*P＜0.05.Compared with model group，＃P＜0.05.Same as below.Figure 1 Comparison of neuromotor function scores

图2 各组大鼠脊髓组织含水量的比较(n＝10)Figure 2 Comparison of spinal cord water content in each group of rats

统计分析各组大鼠脊髓组织EB染色后白蛋白的渗出面积结果如图3所示，sham组大鼠脊髓组织白蛋白的渗出的分布面积区域零；与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织白蛋白的渗出的分布面积明显增大(P＜0.05)；与模型组相比，DHI、DPA组大鼠脊髓组织白蛋白的渗出的分布面积明显减小(P＜0.05)；DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

2.3 电镜观察各组大鼠脊髓组织超微结构改变

电镜下观察大鼠脊髓组织的超微结构结果如图4所示，sham组大鼠脊髓组织结构完整，髓鞘清晰可辨，髓神经纤维排列紧密且有规则，髓鞘与轴突结构均可分辨，内外轴膜以及轴索结构正常，细胞内线粒体分布均匀，结构完整，线粒体嵴结构清晰可辨，未见凹陷或者缺失，核染色质分布均匀，核质界限清晰。模型组大鼠脊髓组织髓鞘结构改变明显，髓鞘间出现巨大间隙，原有的多层致密结构已经消失，或突出形成小囊泡，或断裂，脱髓鞘严重，细胞内线粒体肿胀明显，嵴结构排列紊乱，肿胀、凹陷、缺失明显，核染色质固缩，核膜扩张明显，核质界限不明。DHI组、DPA组大鼠脊髓组织髓神经纤维分布趋于正常，髓鞘结构趋于完整，只有少部分髓鞘板层松散，细胞内多数线粒体结构正常，嵴结构趋于正常。核染色质分布较为均匀，细胞核稍见肿胀，但比模型组以明显好转。

2.4 TUNEL染色检测各组大鼠脊髓组织中的细胞凋亡

TUNEL染色结果如图5所示，与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织内TUNEL阳性明显增多(P＜0.05)，与模型组相比，DHI组、DPA组大鼠脊髓组织内TUNEL阳性明显减少(P＜0.05)DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

统计分析各组大鼠脊髓组织的细胞凋亡率结果如5所示，与sham组相比，模型组的细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)，与模型组相比，经过药物干预后，DHI组、DPA组大鼠的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)。DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

2.5 各组大鼠脊髓组织中的氧化应激检测

本研究中采用DCFH-DA染色来检测大鼠脊髓组织中ROS的水平，DCFH-DA染色结果如图6所示，sham组大鼠脊髓组织中基本不见绿色荧光，与sham组相比，模型组中的DCFH-DA阳性细胞明显增多(P＜0.05)，与模型组相比，DHI组、DPA组大鼠的DCFH-DA阳性细胞明显减少(P＜0.05)，DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

图3 EB染色结果(n＝10)Figure 3 The result of EB staining

注:A:sham组；B:模型组；C:DHI组；D:DPA组。图4 电镜观察各组大鼠脊髓组织的超微结构改变(n＝10)Note.A，sham group.B，model group.C，DHI group.D，DPA group.Figure 4 Ultrastructural changes of spinal cord tissues of rats in each group observed by electron microscopy

统计分析绿色荧光强度结果如图6所示，与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织中细胞的绿色荧光强度明显增强(P＜0.05)，说明模型组大鼠脊髓组织内ROS水平明显升高；与模型组组相比，DHI组、DPA组大鼠脊髓组织内细胞的绿色荧光强度明显减弱，说明大鼠脊髓组织内ROS水平明显降低；DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

用试剂盒检测氧化应激反应中相关底物和酶活性，结果如图7所示，与与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织的MDA的含量明显增加，而SOD酶活性明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，DHI组、DPA组大鼠脊髓组织内MDA的含量明显降低，而SOD酶活性明显增强，差异具有统计学意义(P＜0.05)，DHI组和DPA组相比，差异无统计意义(P＞0.05)。

2.6 Western blot检测各组大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK的表达

为了进一步探讨右美托咪定对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的作用机制，本研究采用Wetern blot法检测大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK蛋白的表达，结果如图8所示，与sham组相比，模型组大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)；和模型组相比，DHI组、DPA组大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。DHI组和DPA组相比，蛋白表达差异不明显(P＞0.05)，不具有统计学意义。

图5 TUNEL染色结果(n＝10)Figure 5 The result of TUNEL staining

图6 DCFH-DA染色结果(n＝10)Figure 6 The result of DCFH-DA staining

图7 各组大鼠脊髓组织氧化应激反应中底物和酶的变化(n＝10)Figure 7 Changes of substrates and enzymes in the oxidative stress response of spinal cord tissue in each group of rats

图8 Wetern blot法检测各组大鼠脊髓组织中CXCR4、p-FAK蛋白的表达(n＝10)Figure 8 Wetern blot detection the expression of CXCR4 and p-FAK protein in spinal cord tissue of rats in each group

3 讨论

SCIRI作为原发性脊髓损伤后的继发性损伤是造成患者神经运动功能受损的重要因素。研究表明[11]SCIRI的病理过程主要是在导致脊髓缺血的因素去除后，脊髓重新供血，但神经功能却没有相对应恢复，反而是在缺血损伤的基础上进一步加重，进而导致脊髓神经元出现迟发性的细胞凋亡，难以维系血-脊髓屏障的完整性，造成患者的运动障碍。由此寻找一种能有效预防或者减轻由SCIRI后的神经细胞凋亡率的药物或者治疗手段是改善脊柱损伤患者治疗及预后的的关键所在。

针对SCIRI的药物研发一直是医药界的研究重点。右美托咪定是临床上用于镇静、镇痛的一线药物。大量的的研究证实[12]右美托咪定具有抗焦虑、稳定血流动力学、抑制交感神经兴奋、减少麻醉用药量、利尿以及抗寒颤的作用。临床研究表明[13]右美托咪定在缺血再灌注损伤中具有明显的器官保护作用。张世平等[14]研究表明右美托咪定可有效降低糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时的心肌细胞的凋亡，降低炎性因子水平，具有明显的心脏保护作用。龚辉等[15]研究证实右美托咪定可减轻大鼠脑缺血再灌注急性期的损伤，抑制神经元变性和凋亡，促进大鼠长期的神经功能恢复。姜远旭等[16]研究表明右美托咪定则能够明显抑制NF-κB的表达，来缓解急性肾损伤后的氧化应激。本研究构建SCIRI大鼠模型后，模型组大鼠神经运动功能评分明显降低，脊髓组织的含水量明显增加，BSCB完整性被破坏；经过右美托咪定干预后DHI组大鼠神经运动功能评分明显升高，脊髓组织的含水量明显降低，BSCB的完整性有所改善。说明右美托咪定对SCIRI大鼠的具有明显的治疗作用。

趋化因子受体(chemokine receptor 4，CXCR4)是基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factoR-1α，SDF-1α)特异性受体。SDF-1α与CXCR4结合后可通过Gi亚基激活其下游的胞质酪氨酸蛋白激酶FAK，使其发生磷酸化生成p-FAK。研究证实[17]CXCR4-FAK信号通路在骨髓源性细胞的黏附、迁移中的各环节中发挥关键作用。Li等[18]研究证实CXCR4-FAK信号通路调控移植骨间充质干细胞向脊髓损伤后的部位迁移，阻滞细胞的异常凋亡，促进脊髓的修复。研究显示[19]CXCR4-FAK信号通路与胚胎期祖细胞的关系密切，由此CXCR4-FAK信号通路可促进机体内许多信号通路的激活，如PI3K/AKT/mTOR信号通路、RAS/MAPK通路、JNK/p38MAP信号通路等，增强细胞的趋化、运动、生长与增殖能力，以抵抗异常的细胞凋亡。当细胞出现应激损伤时，细胞因子表达增加，进而引起CXCR4的表达增加，原始细胞或者祖细胞的免疫应激开始响应，共同协调作用，激活SOD的酶活性等相关酶活性，促进ROS清除，抑制细胞的氧化应激以及细胞的异常凋亡，促进受损组织的再生、修复。Jiang等[20]研究证实提高CXCR4表达后能明显抑制细胞内ROS的蓄积，下调细胞内的氧化应激。本研究使用CXCR4激动剂作为对照组，结果发现在提高CXCR4的表达后，大鼠脊髓组织的细胞凋亡率明显下降，细胞内ROS的含量明显降低，脊髓组织的氧化应激反应减弱，大鼠SCIRI损伤明显好转。观察指标的变化趋势与DHI组变化趋势一致，推断右美托咪定可能通过激活CXCR4-FAK信号通路发挥对SCIRI大鼠脊柱的保护作用。

综上所述，右美托咪定对脊髓缺血再灌注大鼠的保护作用，与CXCR4-FAK信号通路有关，其机制通过激活CXCR4-FAK信号通路，降低ROS的蓄积，抑制氧化应激导致的细胞凋亡，从而发挥对SCIRI后脊髓组织的保护作用。但右美托咪定是否通过其他信号通路发挥对脊髓组织的保护作用还待更深入的研究。