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流感双解方抑制甲型H1N1流感病毒的体外实验研究

2020-05-25周雅萍李国春关晓伟

中国医药导报 2020年12期
关键词:利巴韦林抗病毒

周雅萍 李国春 关晓伟

[摘要] 目的 分析流感双解方抑制甲型H1N1流感病毒的体外实验。 方法 24只新西兰白兔随机分为三组,每组8只。分别给予流感双解方、利巴韦林、生理盐水灌胃并制含药血清,分析药物抑制甲型H1N1流感病毒效果。 结果 甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34(H1N1)TCID50为10-4.575/100 μL。流感双解方与利巴韦林含药血清最大细胞无毒浓度分别为40%与50%。预防感染、直接杀活与复制增殖抑制实验均显示,病毒感染组OD值低于细胞组(P < 0.05),利巴韦林组和流感双解方组OD值均高于病毒感染组(P < 0.05);利巴韦林组和流感双解方组病毒抑制率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 流感双解方具有体外预防、直接杀灭和感染后抑制甲型H1N1流感病毒作用。

[关键词] 流感双解方;甲型H1N1流感病毒;抗病毒;利巴韦林

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210(2020)04(c)-0028-04

Study on inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjie Decoction in vitro experimental

ZHOU Yaping   LI Guochun   GUAN Xiaowei

School of Medicine & Holistic Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province, Nanjing   210023, China

[Abstract] Objective To analysis inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjiefang Decoction in vitro experimental. Methods Twenty-four New Zealand white rabbits were random divided into three groups, eight per group. Influenza Shuangjiefang Decoction, Ribavirin, and normal saline were given by gavage and drug-containing serum was prepared to analyze the effect of drugs on inhibiting influenza A virus. Results The influenza A virus rat lung adaptation strain A/PR8/34 (H1N1) TCID50 was 10-4.575/100 μL. The maximum non-toxic concentration of influenza Shuangjiefang Decoction and Ribavirin-containing serum were 40% and 50%, respectively. The experiments prevent infection, direct inactivation and replication proliferation inhibition showed that the OD value of the virus infection group was lower than that of the cell group (P < 0.05); the OD value of the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group were higher than that of the virus infection group (P < 0.05). There was no statistically significant difference in virus inhibition rate between the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group (P > 0.05). Conclusion Influenza Shuangjiefang Decoction has the functions of in vitro prevention, direct killing and inhibition of influenza A virus after infection.

[Key words] Influenza Shuangjie Decoction; Influenza A virus; Antiviral; Ribavirin

流感病毒(IFV)是具有囊膜、多节段的单股负链RNA病毒,属于正黏病毒科[1]。根据抗原性差异和基因特性差异,主要存在甲、乙、丙3种类型的病毒,而流行病学上最容易发生的是甲型流感病毒[2-3]。流感雙解方是国医大师周仲瑛所拟抗呼吸道病毒方,临床研究显示其能有效促进肺炎吸收和流感病毒抗原转阴[4-5]。本实验主要分析流感双解方对甲型H1N1流感的预防、直接杀灭与抑制作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

犬肾上皮细胞株(MDCK)、甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34(H1N1),均由江苏省疾病预防控制中心提供。

DMEM培养基(上海博湖生物科技有限公司);四甲基偶氮唑盐(上海联硕生物科技有限公司);新生牛血清(南京全隆生物技术有限公司);胰酶(上海中西三维药业有限公司)。96孔微孔混匀仪(QB-8001,海门市其林贝尔仪器制造有限公司);CO2培养箱(JYWD8698,北京金洋万达科技有限公司);台式冷冻离心机(5810R型,Eppendorf公司);酶联免疫检测仪(HBS-1096B,上海贺琛能源科技有限公司)。

1.2 实驗动物

选择南京中医药大学医学院动物中心的SPF级健康雄性新西兰白兔24只,体质量2.0~2.5 kg,平均(2.2±1.2)kg。饲养条件:湿度7%~10%,温度25℃左右,每日光照12 h,予以普通兔饲料、饮用级纯净水常规饲养,保持环境清洁卫生与通风。本研究经南京中医药大学医学院动物伦理委员会批准。

1.3 实验药物

流感双解方(南京中医药大学百草堂),根据实验动物临床用药剂量原则[6-7],浓缩至浓度为0.908 g/mL;利巴韦林颗粒(山东立强药业股份有限公司),稀释药物浓度为0.456 mg/mL;均置于4℃冰箱保存[8]。

1.4 方法

1.4.1 含药血清的制备  24只白兔于实验室饲养3 d后,随机分为三组,每组8只。第4~6天进行不同方式的灌胃处理,2次/d。其中空白血清组给予50 mL生理盐水,流感双解方组灌胃量36.32 mg/(kg·d),利巴韦林组18.24 mg/(kg·d)。第6天给药完毕1 h后,进行颈动脉采血,务必保证白兔是在清醒的状态下,采集的标本静置3 h后,3000 r/min(离心半径15 cm)离心15 min后取上清液,56℃水浴灭活30 min,过滤后分组保存,保持-20℃。

1.4.2 细胞病变(CPE)法测定病毒对MDCK细胞的半数感染量(TCID50)  MDCK细胞以1×105个/mL细胞浓度接种,100 μL/孔,置37℃、5%CO2培养箱(余下实验培养箱温湿度条件相同)培养,甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34(H1N1)病毒悬液用维持液10倍稀释(10-1~10-8)8个浓度。待发现MDCK细胞为单层时,吸弃培养液,再进行磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,接种不同浓度的H1N1病毒悬液,100 μL/孔,并使其均匀吸附,吸弃病毒液后每孔加入含2%小牛血清维持液100 μL继续培养,即时观察病变。正常细胞对照孔则加入100 μL维持液;以最高稀释度不再出现新病变时为终点,观察出现细胞病变效应(CPE)的孔数,无病变为(-),≤25%细胞病变为(+),>25%~50%为(++),>50%~75%为(+++),>75%为(++++)。根据Reed-Muench法[9]计算TCID50:距离比=(高于50%百分数-50%)/(高于50%百分数-低于50%百分数),TCID50=距离比+高于50%病变病毒最高稀释度的对数。

1.4.3 MTT法测药物最大无毒浓度  MDCK细胞以1×105个/mL细胞浓度接种,长成单层后,分别加入不同浓度(10%~100%)的流感双解方、利巴韦林含药血清,并设正常细胞对照组。培养24 h,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,使其均匀吸附,培养4 h,吸弃上清液,每孔加入150 μL DMSO,测定各孔光密度值(OD值),计算各药物的最大无毒浓度。上述三组均以每组8只新西兰白兔的血清标本按1~8标签逐次实验,取其均值分析。细胞存活率=加药组OD值/对照组OD值×100%。以细胞存活率≥90%作为药物最大无毒浓度。

1.5 观察指标

1.5.1 药物对病毒感染的预防作用  0.25%胰酶消化单层MDCK细胞,以1×105个/mL的细胞浓度接种培养。待细胞长满所需密度(80%~90%)时吸去培养液,PBS洗两遍。分为细胞组、病毒组、利巴韦林组和流感双解方组,每组8份,按血清标本1~8标签逐次加入药物血清。药物组加入相应药物,细胞对照组与病毒组加入细胞维持液。培养24 h后,吸去培养液,PBS洗两遍。除细胞组加维持液外,其他三组细胞均用100 TCID50/100 μL IFV感染;逐日在倒置显微镜下观察,直至发现病毒感染组细胞CPE达(++++)时加入预先过滤除菌5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔,继续培养4 h;吸去上清液,加入DMSO溶液150 μL/孔,测定OD值。通过公式计算药物对病毒的抑制率:病毒抑制率(%)=(药物组平均OD值-病毒感染组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒感染组平均OD值)×100%。观察药物对病毒的预防作用。

1.5.2 药物对病毒感染的直接灭活作用  分别将流感双解方血清、利巴韦林血清与等体积的100 TCID50流感病毒在无菌EP管中混匀,置培养箱里培养,按照“1.5.1”方法进行MDCK细胞的培养及分组。除病毒组应用100 TCID50/100 μL IFV感染外,其余组均加入维持液100 μL;经培养箱吸附、PBS清洗等操作后,三组分别加入利巴韦林血清和病毒混合液、流感双解方血清和病毒混合液、细胞维持液,100 μL/孔,继续培养4 h;余下步骤同“1.5.1”。观察药物对病毒的直接灭活作用。

1.5.3 药物对病毒吸附后复制增殖的抑制作用  按照“1.5.1”方法进行MDCK细胞的培养、分组,用100 TCID50/100 μL IFV感染各组细胞(细胞组不感染,加维持液100 μL);进行培养箱吸附、PBS清洗等操作后,分别加入利巴韦林血清、流感双解方血清、细胞维持液,100 μL/孔,培养4 h;余下实验步骤同“1.5.1”。观察药物对病毒吸附后复制增殖的抑制作用。

1.6 统计学方法

选择SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFV干预MDCK细胞出现细胞病变效应情况

MDCK细胞中流感病毒H1N1亚型TCID50为10-4.575/100 μL。IFV干预MDCK细胞出现细胞病变效应情况见表1。

表1   IFV干预MDCK细胞出現细胞病变效应情况

注:IFV:流感病毒;CPE:细胞病变效应

2.2 不同浓度含药血清对MDCK细胞存活率的影响

正常对照组细胞存活率为100%,流感双解方组与利巴韦林组不同浓度含药血清的MDCK细胞存活率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表2。流感双解方与利巴韦林含药血清最大细胞无毒浓度分别为40%(0.363 g/mL)、50%(0.228 mg/mL)。

表2   不同浓度含药血清对MDCK细胞存活率的影响(%,x±s,n = 8)

注:正常对照组细胞存活率为100%

2.3 四组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制OD值比较

病毒感染组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制的OD值明显低于细胞对照组(P < 0.05);利巴韦林组和流感双解方组OD值均高于病毒感染组(P < 0.05);利巴韦林组与流感双解方组间OD值比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表3。

表3   四组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制OD值比较

(x±s,n = 8)

注:与细胞对照组比较,△P < 0.05;与病毒感染组比较,*P < 0.05

2.4 两组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制病毒抑制率比较

两组预防感染、直接灭活、复制增殖抑制的病毒抑制率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表4。

表4   两组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制病毒抑制率比较

(%,x±s,n = 8)

3 讨论

中药抑制甲型H1N1流感病毒取得不错疗效[10-13]。周仲瑛教授针对流感病毒遵循“气营两清、表里双解、祛邪外达”的原则,流感双解方是其防治外感热病的临证经验方,具有清气泻热、凉营解毒等功效[14-16]。为此,本研究以新西兰白兔为实验对象,分析了流感双解方对甲型H1N1流感病毒的抑制作用及应用价值。

实验中,甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34(H1N1 TCID50为10-4.575/100 μL。分别筛选出浓度40%(0.363 g/mL)的流感双解方、50%(0.228 mg/mL)的利巴韦林含药血清为最大细胞无毒浓度。在含药血清浓度超过上述值时,会发生明显的细胞病变,出现细胞皱缩、细胞间隙变大、胞质不透明、粗糙、部分细胞脱落等现象[17]。因此认为,将≤0.363 g/mL的流感双解方用于甲型流感病毒感染的新西兰白兔体外实验时,细胞存活率>90%。

进一步实验显示,IFV感染MDCK细胞后,药物对H1N1亚型流感病毒预防感染、直接灭活及病毒吸附后复制增殖抑制的OD值较病毒感染组均有明显升高。OD值作为被检测物吸收掉的光密度值,通过检测OD值能够了解药物对MDCK细胞活性的保护作用。OD值越高,提示活细胞数量越多、细胞活性越佳[18]。本研究显示,流感双解方用于H1N1亚型流感病毒预防感染、直接灭活及吸附后复制增殖抑制时,均能获得较好的干预效果,细胞活性率佳;流感双解方组所检测OD值与利巴韦林组比较,差异无统计学意义(P > 0.05),提示流感双解方应用于H1N1亚型流感病毒治疗中时能获得与利巴韦林相似的效果。在两种药物的病毒抑制率比较中,无论是药物对流感病毒预防感染的抑制率,还是对直接灭活和病毒吸附后复制增殖抑制的抑制率,流感双解方组与利巴韦林组比较,差异无统计学意义(P > 0.05),这进一步肯定流感双解方用于H1N1亚型流感病毒治疗中的理想效果。

H1N1亚型流感具有起病急、传变快等特点,早期表现为邪由表入里,里热渐起,继而传营入里。因此,在治疗上需遵循“表里双解、汗和清下”的辨证治疗思路[19-20]。流感双解方作为治疗外感热病的经验方,能通过多途径、多靶点灭活流感病毒,抑制病毒吸附与增殖,从而充分发挥对H1N1亚型流感病毒感染的治疗作用。其主要由金银花、连翘、北柴胡、荆芥、酒大黄、生石膏、知母、黄芩、淡竹叶、芦根等十余味中草药所组成[21-22],诸药合用,共奏疗效,对减轻炎性病变、抑制细胞凋亡有良好作用。

综上,流感双解方在H1N1亚型流感病毒感染的预防、直接灭活和复制增殖抑制方面均有较为理想的抑制作用。本研究可为中医药抑制流感病毒的临床应用提供科学依据,能在一定程度上促进中医药诊治重大疾病的转化应用。

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(收稿日期:2019-10-25  本文编辑:王晓晔)

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