闫东科,宫艳超,吕 平*,许凤霞,李 冬,马素静

1.天津职业大学 生物与环境工程学院,天津 300350

2.天津渤海职业技术学院 环境与化工学院,天津 300402

变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌如β变形菌（纲）奈瑟菌属脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟球菌分别是引起人类疾病细菌性脑膜炎和淋病的病原菌。系列多聚磷酸激酶ppk2基因的突变研究证实PPK2 与病原菌的发病机制有关。例如，下调ppk2基因可减慢结核分枝杆菌对巨噬细胞的侵入，敲除ppk2基因则可降低结核分枝杆菌在热、酸和低氧应激下的存活[1]；经结核分枝杆菌ppk2突变株感染的豚鼠其组织病理学特征和细菌负荷均减少[2]；土拉热弗朗西斯菌ppk2突变株对抗生素的敏感性升高且在巨噬细胞中表现出生长缺陷[3]。

ppk2基因在原核微生物体内广泛存在。例如，在脑膜炎奈瑟菌血清B 群[4]、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷伯菌、约氏不动杆菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌等病原菌中均存在PPK2 同源物。但尚未在植物和后生动物（包括人类）中发现ppk2基因[5]。因而，靶向病原菌中多聚磷酸激酶PPK2 的新型抗生素开发被认为是一个理想的策略[2]。

本研究将围绕β变形菌CB[6]中PPK2 同工酶（Gi_505233881，WP_015420983.1，以下简称：ΔPPK2）展开。首先，采用生物信息学方法预测ΔPPK2 蛋白的二级结构和基本理化性质；其次，利用物理转化法将重组表达载体ΔPPK2/pET30a 转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞，IPTG 诱导ΔPPK2 蛋白试表达；最后，放大培养获得的ΔPPK2 蛋白依次进行Ni-IDA 亲和色谱柱、阴离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱分离纯化，以期获得满足蛋白质晶体学研究要求的ΔPPK2 蛋白，为后续的结构、功能研究和靶向ΔPPK2 蛋白的抗生素开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与材料 限制性核酸内切酶（NdeI、HindⅢ和ApaI）、SDS-PAGE Marker 和DNA Marker均购自美国Thermo 公司；Western blot Marker 购自德泰生物科技（南京）有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术（上海）有限公司。另外，实验以质粒pET30a 作为表达载体（卡那抗性，ΔPPK2 蛋白N 端仅含有6×His 标签，纯化过程中未切除），Δppk2目的基因由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要仪器与设备AKTA 蛋白纯化仪、凝胶过滤色谱柱Superdex200 Increase10/300 GL、Ni-IDA亲和柱和阴离子交换柱HitrapQ HP 1 mL 均购自美国GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学预测 利用PSIPRED 网站（http://web.expasy.org/protparam）预测ΔPPK2 蛋白的二级结构；利用ExPASy 网站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测ΔPPK2 基本理化性质。

1.2.2 全质粒酶切和测序 利用限制性核酸内切酶ApaI和HindⅢ对重组表达质粒ΔPPK2/pET30a 进行全质粒酶切鉴定；目的基因Δppk2的测序工作由金维智生物科技有限公司完成。

1.2.3 ΔPPK2 蛋白试表达与鉴定 物理法转化重组表达质粒ΔPPK2/pET30a 进入感受态细胞E.coliBL21（DE3），接种筛选出的单克隆到5 mL LB 液体培养基（含50 μg·mL-1卡那）中培养至OD600值为0.5～0.8 时，加入IPTG 使其终浓度为0.2 mM·L-1，并分别置于16 ℃、25 ℃、37 ℃条件下诱导ΔPPK2 蛋白表达。诱导后的菌液进行SDS-PAGE 电泳分析。基于电泳结果，通过Western blot 实验进一步分析鉴定ΔPPK2 蛋白的表达情况。

1.2.4 ΔPPK2 蛋白的放大培养 根据上述试表达结果确定出最优诱导表达ΔPPK2 蛋白的温度，采用培养3 L 菌液进行放大培养，诱导ΔPPK2 蛋白表达的时间一般为16～18 h。

1.2.5 Ni-IDA 亲和层析纯化 全菌采用50 mM·L-1Tris-HCl（pH8.5）、300 mM·L-1NaCl、20 mM·L-1咪唑含1%TritonX-100、1 mM·L-1PMSF 超声裂解，采用咪唑缓冲液浓度梯度洗脱ΔPPK2，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.2.6 阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化 首先，使用阴离子交换柱（HitrapQ HP）进行分离纯化，根据出峰位置进行SDS-PAGE 电泳分析；然后，利用凝胶过滤色谱柱（Superdex200）进一步纯化，根据出峰位置进行SDS-PAGE 电泳分析。ΔPPK2 蛋白经浓缩测定浓度后于-80 ℃冰箱内保存。

2 结果与分析

2.1 ΔPPK2 蛋白生物信息学预测

利用网站ExPASy 统计、分析ΔPPK2 蛋白的基本理化性质（如表1）。由ΔPPK2 的pI 值为5.69可知：在后续的分离纯化过程中可选用pH8.5，50 mM·L-1Tris-HCl 缓冲液进行阴离子交换色谱分离纯化；利用PSIPRED 网站预测ΔPPK2 蛋白的二级结构，ΔPPK2 不存在跨膜结构域和信号肽，应为胞内可溶性蛋白，且α螺旋和β折叠片层的分布较为均匀。

表1 ΔPPK2 基本理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of ΔPPK2

2.2 ΔPPK2/pET30a 全质粒酶切鉴定

ΔPPK2/pET30a 重组表达载体全长6180 bp，其中，Δppk2基因长903 bp。利用限制性核酸内切酶ApaI和HindⅢ进行全质粒酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳分析，在同一泳道上应有一个4216 bp 的条带和一个1964 bp 的条带。如图1 与上述预期相符。

图1 ΔPPK2/pET30a 重组表达载体的全质粒酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant expression vector PPK2/pET30a by restriction enzyme digestion

2.3 ΔPPK2 蛋白试表达与鉴定

试表达产生的ΔPPK2 蛋白N 端仅含有6×His 标签，根据表1 中ΔPPK2 蛋白分子量预测结果，ΔPPK2 蛋白在SDS-PAGE 电泳时的分子量应约为35 ku。如图2 与预期大小相一致，且16 ℃下诱导表达的ΔPPK2 蛋白表达量与状态更为理想，后续放大培养阶段选择在16 ℃下进行。为进一步确定上述实验结果，对16 ℃下的试表达菌液进行western blot 分析，结果显示，抗ΔPPK2 蛋白N 端6×His标签的抗体曝光位置同样位于35 ku 处（如图3）。

图2 SDS-PAGE 分析ΔPPK2 蛋白试表达情况Fig.2 SDS-PAGE analysis of ΔPPK2 trial expression

图3 Western blot 鉴定ΔPPK2 蛋白16 ℃下表达情况Fig.3 Western blot analysis of ΔPPK2 expression under 16 ℃

2.4 Ni-IDA 亲和层析分离ΔPPK2 蛋白

将3 L 用于放大培养的表达菌液经IPTG 诱导、超声破碎、离心后过Ni-IDA 亲和色谱柱，SDS-PAGE 电泳分析不同浓度咪唑洗脱ΔPPK2 蛋白情况。如图4，ΔPPK2 蛋白存在于全菌破菌离心后上清，蛋白可溶性良好，300 mM·L-1咪唑可充分洗脱ΔPPK2 蛋白，基本未发生“黏柱子现象”且蛋白纯度较高。

图4 ΔPPK2 过Ni-IDA 亲和柱纯化结果Fig.4 The purification result of ΔPPK2 via Ni-IDA affinity column

2.5 ΔPPK2 蛋白的纯化

亲和色谱洗脱下来的ΔPPK2 蛋白首先利用HitrapQ HP 阴离子交换柱进行纯化，阴离子交换色谱图（如图5）呈现较对称的单峰，说明ΔPPK2 蛋白带电性质较为均一。吸取Q21-Q24 管洗脱液5 μL进行SDS-PAGE 电泳分析（如图6）。ΔPPK2 蛋白在凝胶过滤色谱柱上的色谱图呈现对称单峰（如图7），洗脱峰值出现在14.24 mL，说明ΔPPK2 蛋白在溶液中以单体形式存在。吸取D18-D23 管洗脱液5 μL 进行SDS-PAGE 电泳分析（如图8），ΔPPK2 蛋白纯度较高。将D18-D23 管洗脱液混匀浓缩至60 μL，测定蛋白浓度为12 mg·L-1，纯度为95%。

图5 ΔPPK2 蛋白的阴离子交换色谱纯化Fig.5 The purification result of ΔPPK2 by anion exchange chromatography

图6 SDS-PAGE 分析阴离子交换色谱纯化ΔPPK2 蛋白Fig.6 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by anion exchange chromatography

图7 ΔPPK2 蛋白的凝胶色谱纯化Fig.7 The purification result of ΔPPK2 by gel filtration chromatography

图8 SDS-PAGE 分析凝胶色谱纯化ΔPPK2 蛋白Fig.8 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by gel filtration chromatography

3 讨论

PPK2 在不同的微生物中以不同的寡（多）聚体（二聚体、四聚体和八聚体）存在，但具有相似的基本结构，均含有保守的分别与NTP 的β和γ位磷酸基团结合的Walker A 和Walker B 基序，而盖子模序促进这些结合作用，并与Walker A/B 基序组成P-环NTP 水解酶结构域[7]。目前，针对病原菌中PPK2 活性的抑制剂（抗生素）研究主要基于PPK2 的寡（多）聚化进行。例如，G-四链体对结核分枝杆菌PPK2的八聚体复合物具有显著抑制作用，且通过对霍乱弧菌PPK2和香港海鸥型菌PPK2的有效抑制表现出广谱活性[8]。值得一提的是，红色亚栖热菌PPK2 和土拉热弗朗西斯菌PPK2 与不同核苷酸底物的晶体结构表明[9]，对酶活性中心的阻碍作用或对发生底物转移的盖子区域的阻碍作用被认为是PPK2 靶向研究的新方向[10]，这就对PPK2 激酶的立体空间结构解析工作提出了要求。

本研究利用ΔPPK2/pET30a 重组表达载体，通过16 ℃，终浓度为0.2 mM·L-1IPTG 诱导ΔPPK2蛋白在E.coliBL21（DE3）中高效可溶性表达，依次通过Ni-IDA 亲和色谱柱、阴离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱进行分离纯化，获得了浓度为12 mg·mL-1，纯度为95%的且具有高度均一性的ΔPPK2 蛋白。纯化出的ΔPPK2 蛋白既可用于多聚磷酸激酶活性检测和宿主细胞内相互作用蛋白的筛选，又可用于蛋白质晶体培养和X 射线蛋白晶体三维立体空间结构解析的科学研究，从而使靶向ΔPPK2 蛋白的新型致病菌抑制剂（抗生素）的开发成为可能。因此，本研究为深入研究ΔPPK2 蛋白的结构和功能奠定了实验基础。