江驰航 胡子文 王智诚

摘要 由于形态学无法更精准地鉴别部分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀，因此需要通过分子手段鉴别此类无法直观辨认的东方鲀。该研究以15尾红鳍东方鲀和30尾暗纹东方鲀为材料，使用NCBI上红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的线粒体全基因组中3个基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守区域通过Primer 5.0进行引物设计。将45个样品在摸索得到的最适条件下进行扩增并测序，对测序结果进行检验，分析种间差异并进行碱基组成性分析，得出COⅠ上有9个SNPs，COⅡ上有4个SNPs，COⅢ有10个SNPs，使用MEGA-X进行进化树分析得出，该研究所设计的引物可以有效地鉴别2种东方鲀。

关键词 红鳍东方鲀;暗纹东方鲀;种质鉴定;分子标记

Abstract Because morphology cannot identify some Takifugu rubripes and Takifugu obscurus more accurately，molecular means must be used to identify such invisible Takifugu.In this study，15 T.rubripes and 30 T.obscurus were used. Three genes COⅠ，COⅡ，and COⅢ in the entire mitochondrial genome of T.rubripes and T.obscurus on NCBI were performed by Primer5.0 designed for primer design.Fortyfive samples were amplified and sequenced under the optimal conditions，and the sequencing results were checked. The differences between species were analyzed and base composition analysis was performed. It was found that there were 9 SNPs on COⅠ，4 SNPs on COⅡ and 10 SNPs on COⅢ. Using MEGA-X to analyze the phylogenetic tree，we can conclude that the primers designed in this study can effectively identify two Takifugu species.

Key words Takifugu rubripes;Takifugu obscurus;Germplasm identification;Molecular marker

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）俗称黑蜡头、虎河豚，与暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）均属于鲀形目（Tetraodontiformes）、鲀科（Tetraodontidae）、东方鲀属（Takifugu），在我国分布于黄海、渤海、东海，是我国比较重要的几种经济养殖鱼类之一，其味道鲜美，肉质细腻，鱼皮富含胶原蛋白，鱼肉蛋白质含量极高，而且其中所含有的河豚毒素也具有很高的价值，已在中国、日本以及韩国等亚洲国家广泛培育[1-2]。

通过动物形态学去鉴别物种，是物种鉴别常见也是最基础的方法，具有简单直观等优点。生物学具有悠久发展历史，自动物解剖开始，到动物形态学，再到宏观形态学研究，目前已发展成为包括解剖学、比较解剖学、细胞学和组织学、古动物学和胚胎学等的综合性学科[3]。形态学方法可概括为可数性状、可量性状、结构特征等[4] 。但因为其判断的主观性强，需要比较专业的系统学知识，而且由于不同发育阶段的形态学和地理隔绝也存在着差异，容易导致判断的错误，因此需要更精确的鉴定方式去鉴别形态学中无法辨认的隐形种。

聚合酶链式反应（PCR）是一种应用分子生物学将目的DNA片段在生物体外放大扩增的一项技术，其利用DNA在高温时破坏氢键变性成单链，降温时复性使引物（能与目的基因互补配对的寡核苷酸片段）与目的基因單链结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度72 ℃，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5′—3′）的方向合成互补链[5]。通过对不同物种基因的保守区段设计引物，可应用该技术获得多个物种的同一基因的类似片段，比较这些基因片段的差异程度可判断这些物种的亲缘关系及区别鉴定这些物种。线粒体DNA（mtDNA）是一种在进化过程中替换率比DNA的高5～10倍并广泛存在于生物体内的遗传物质，已经被广泛利用于动植物的种群遗传学研究[6-7]，其中COⅠ基因是细胞色素氧化酶3个亚基基因中的一个相当保守的蛋白质编码基因，基因组中很少存在插入和缺失，其普遍替代速率为0.016 8～0.023 0每个位点/每百万年[8-9]，长为658 bp左右的十分适合解析亲缘关系相近的分类类群[10]。国内外已经有研究者通过此段序列对未知物种进行系统的分类，并且打破传统形态学的物种分类[11-12]，COⅡ与COⅢ同样存在于mtDNA中，其组成也是十分保守。

SNP是单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism），属于第三代分子标记技术，是在基因组水平上的单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，具有可以稳定遗传的优点，故此通过查找在不同物种间存在的SNP能有效地将这些物种加以区分，同样当某一物种的不同性状出现SNP时，则可以利用对SNP的筛选进行育种。 该方法已有应用的先例，Lin等[13]利用 SNP 成功建立了大黄鱼有效的鉴定遗传性别的方法。

该研究使用多条红鳍东方鲀与暗纹东方鲀，通过查找在两种群间有差异而在群体中无差异的SNP作为鉴定两种群差异的分子标记。通过设计引物在PCR反应中将这些存在于遗传信息中的差异放大，借助测序技术及生物分析筛出这些可作为分子标记的SNP。检测这些SNP可鉴别这两群体间难以通过形态学鉴定个体，可应用于养殖育种、食品检疫、生态环保等领域。

2.4 2种东方鲀基因进化树分析

使用MEGA-X中的邻接法（NJ）模型，使用其测序修剪长度的DNA片段构建所有个体的系统发育树（图5～7），检验方法使用Bootstrap method重复 1 000次。在3个基因的进化树中红鳍东方鲀15个个体（图中编号为31～45）和暗纹东方鲀30个个体（图中编号为1～30）分别聚为一支，说明所设计的这3对基因引物的扩增产物能有效地区分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀。

3 讨论

近些年来，分子标记在水产动物遗传育种中的应用越来越广泛。SNP具有普遍性、稳定性且检测十分简便，而且部分特殊SNP可以直接影响生物本身的性状，SNPs也会根据地理环境的不同具有不同的性状特点[14]。

该研究以45个红鳍东方鲀和暗纹东方鲀肌肉组织为材料，在COⅠ中筛选出了9个种间特异性SNPs，均为同义突变;在COⅡ中筛选出了4个种间特异性SNPs，其中A371G发生了错义突变，红鳍东方鲀密码子为GTC即缬氨酸，暗纹东方鲀为ATC即异亮氨酸，均位于线粒体内膜外。在暗纹东方鲀COⅡ中的第385位发生了错义突变，密码子由ACC突变为GCC，氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸，均位于线粒体内膜外。

在COⅢ中筛选出了10个种间特异性SNPs，其中T310G发生了错义突变，红鳍东方鲀密码子为GCA即丙氨酸，暗纹东方鲀为TCA即丝氨酸，位置在非跨膜区。

这些筛选出的23个SNPs可作为鉴别2种东方鲀的分子标记，并且等位基因数是反映某一位点在进化过程中所积累遗传变异程度的重要指标。等位基因数越高表明此位点在进化历史上的突变越活跃，该物种有多种方式适应自然选择，对复杂生存环境的适应力也越强[15-16]。红鳍东方鲀群体数少但是 变异位点数更多，说明红鳍东方鲀所处环境更复杂。

参考文献

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