侯阿娜，曲双双，富建华

（1.中国医科大学附属盛京医院儿科，沈阳 110004；2.北部战区总医院儿科，沈阳 110016）

近年来，极低和超低出生体质量婴儿的存活率明显提高，但随之而来的脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia，PVL）发病率居高不下［1］。PVL作为早产儿脑白质损伤的最严重形式，已成为影响低出生体质量婴儿日后生存质量的主要疾病。我国研究［2］结果显示早产儿PVL发生率为8%～26%，在极低出生体质量婴儿中PVL发生率为5%～17%，其中74.2%以上发生脑瘫。PVL的病因较为复杂，目前研究［3-6］认为与缺氧缺血（hypoxia ischemia，HI）、全身感染和炎症反应、小胶质细胞活化、兴奋性毒性、自由基损害以及大脑白质少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs）自身的发育易损性等有关。而HI始终被认为是其发病的主要原因，其病理学基础为OLs弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍［7-8］。

连接蛋白47（connexin 47，Cx47）是缝隙连接蛋白家族的一员，可通过缝隙连接通道直接介导细胞间缝隙连接通道（gap junctional intercellular communication，GJIC），参与并影响细胞死亡过程［9］。Cx47被证实可形成Cx47/Cx47和Cx47/Cx43等功能性缝隙连接，促使细胞间营养物质、离子、第二信使及小分子（约1×103）等通过，在中枢神经系统髓鞘的形成和损伤修复中起到关键的作用［10］。Cx47缺乏可引起遗传性脱髓鞘疾病［11-13］。PARENTI等［12］通过实验证实Cx47广泛存在于OLs和髓鞘当中，既在髓鞘形成早期的发展过程中，也参与新髓鞘的形成，且在脱髓鞘后髓鞘再生的恢复阶段表达被上调。由于PVL的晚期病理结局主要为OLs弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍，Cx47是否参与此阶段的髓鞘损伤及修复，目前尚不清楚。因此，本研究在建立HI致PVL模型的基础上，动态监测Cx47的表达变化，旨在阐明Cx47是否与PVL髓鞘的损伤及修复相关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备

健康清洁级3日龄SD大鼠120只（中国医科大学附属盛京医院实验中心提供），随机均分为HI组（n=60）、对照组（n=60），雌雄不限。按本课题组以往PVL动物模型建立方法［14］，将3日龄SD大鼠吸入性乙醚麻醉，仰卧位显微镜下固定，碘伏消毒后，在颈部紧贴气管右侧切纵形切口（0.5～1.0 cm），分离并用7/0一次性缝合线结扎右侧颈总动脉，在结扎的两端之间将动脉剪断，防止结扎线脱落缺血不彻底，缝合切口，表皮用生理盐水清洗干净（手术时间＜5 min），术后将新生鼠放入恒温低氧箱2 h（92%氮气和8%氧气混合气体）；然后返回母鼠身边饲养。对照组仅分离右侧颈总动脉，不结扎也不暴露于低氧中。

1.2 标本采集及制备

2组分别于术后1、3、7、14 d处死大鼠，每个时间分别处死15只。乙醚吸入麻醉后，0.9%生理盐水左心室灌注，4% 多聚甲醛溶液固定，断头取脑，以视交叉为中心前后2 mm取脑组织。分别用于 HE染色、透射电镜分析、免疫组化和免疫荧光观察、Western blotting和实时PCR检测。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色观察脑组织形态：取各时间点脑组织后，4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋，连续冠状切片，片厚4.5 μm。二甲苯、乙醇梯度脱蜡后进行HE染色，每组各时间点随机抽取6张，每张切片光镜下（×400）随机选取5个脑室周围脑白质视野观察病理改变。

1.3.2 透射电镜观察OLs间缝隙连接超微结构：对照组及HI组大鼠各2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后迅速断头取脑，选取脑组织右侧白质（1 mm3），置于 2.5%戊二醛 4 ℃保存。1%锇酸 4 ℃下固定24 h后，用 30%～100%浓度丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片（片厚约50 μm）。切片用醋酸双氧铀及硝酸铅双重染色后，在JEM-1200Ex透射电镜（日本Hitachi Electronic公司）下识别具有特殊超微结构特征的OLs及其缝隙连接，观察OLs间缝隙连接状态的超微结构。

1.3.3 免疫组化检测Cx47、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）表达及定位：脑组织石蜡切片常规脱蜡后，3%过氧化氢溶液室温处理20 min；标准柠檬酸缓冲液进行微波修复；山羊血清室温封闭30 min；滴加一抗（Cx47 1 ∶200，兔抗大鼠抗体购自美国Santa Cruz公司；MBP 1 ∶300稀释，兔抗大鼠抗体购自美国Abcam公司）4 ℃过夜；阴性对照以PBS替代一抗。0.01 mol/L PBS洗涤，滴加生物素标记的羊抗兔IgG（免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司），37 ℃30 min；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37 ℃30 min；DAB显色（北京中杉金桥生物技术公司），苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用美国 Universal Imaging Porporation图像分析系统，应用MetaMorph软件，测定平均光强度以表示阳性产物的强度。同时采用连续切片方法双标Cx47及MBP，进而实现Cx47及MBP的共定位。

1.3.4 Western blotting测定Cx47、MBP蛋白表达水平：按照文献［15］方法，取右侧脑组织50～80 mg，提取蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。加入细胞裂解液及缓冲液，加热变性。各标本蛋白（20 μL）上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -PAGE），转印，Tris盐酸缓冲液（TBST）漂洗，脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加一抗Cx47（1 ∶800）、MBP（1 ∶1 000），4 ℃过夜，阴性对照加TBST代替一抗。TBST洗3次，每次10 min，二抗（山羊抗兔1 ∶2 000；山羊抗小鼠 1：2 000购自北京中山金桥生物技术有限公司）工作浓度1 ∶2 000室温孵育2 h，TBST洗 膜3次，每 次10 min，GAPDH做内参各组进行对比。最后进行化学发光（ECL kit；Santa Cruz Biotechnology）显色。结果用凝胶图像分析系统（Chemi Imager 5500 V2.03软件）进行吸光度扫描分析，并用图像分析系统（Fluor Chen 2.0软件）对扫描图像进行分析。脑组织内的蛋白用平均灰度值表示，蛋白灰度值越高表示蛋白含量越高。

1.3.5 实时PCR方法测定Cx47、MBP基因表达：应用Trizol-丙酮沉淀法提取RNA，按TaKaRa反转录试剂盒说明反转录合成cDNA［15］。引物由上海生工公司设计并合成，见表1。采用TaKaRa实时-染料法（20 μL体系）进行定量PCR扩增。Cx47mRNA的相对表达量应用2-ΔΔCt法进行计算。

1.4 统计学分析

表1 实时PCR测定基因表达引物列表Tab.1 RT-PCR primer sequences

2 结果

2.1 一般状态及行为改变

对照组大鼠一般状态反应良好，吃奶好，肤色红润，生长发育迅速。而HI组逐渐出现状态反应差、周身循环不良、皮肤发绀、苍白等表现，随着低氧时间延长皮肤苍白逐渐加重，继而出现烦躁不安，激惹，有时可见四肢抽搐，最终出现嗜睡、大小便失禁等表现，恢复喂养后症状缓解。但随生长发育时间的延长，HI组出现明显活动减少、运动不协调、睁眼障碍及生长发育延迟等表现。

2.2 形态学变化

光镜下，对照组脑组织形态结构正常，细胞分布均匀、排列紧密有序，细胞结构完整，核圆形、淡染，染色清晰，随着大鼠日龄的增加细胞逐渐成熟变大，细胞形态更加完整清晰（图1A、1B、1C、1D）。HI组1 d脑白质内胶质细胞间隙增宽，细胞变形，排列紊乱，少量细胞出现核固缩（图1E），手术后3 d胶质细胞大量坏死，并伴有脑白质广泛结构疏松、紊乱，可呈筛网状坏死，形成空洞等（图1F）。与手术后 3 d比较，手术后7、14 d溶解坏死细胞逐渐修复，脑白质病变及坏死区域明显减轻，筛网状损伤基本消失，取而代之的是条索状、点状及囊性坏死，最终形成软化灶（图1G、1H）。

2.3 脑组织缝隙连接超微结构变化

对照组可见到OLs形态结构完整，细胞膜及核膜明显，胞核大而清晰，核内染色质丰富且分布均匀。OLs通过致密的缝隙连接直接相连（图2A）。与对照组比较，HI组OLs形态极其不规则，结构明显异常，随损伤加重大量细胞溶解坏死，细胞核结构甚至消失，核染色质浓缩、异染，细胞间缝隙连接断裂不连续（图2B）。

2.4 免疫组化检测脑组织内蛋白的表达

图1 各组脑组织形态学改变 HE× 400Fig.1 Morphological changes in brain tissue in each group HE× 400

图2 透射电镜下观察HI对少突胶质细胞间缝隙连接通道的影响× 8 000Fig.2 The effect of HI on oligodendrocyte gap junctions observed under a transmission electron microscope × 8 000

2.4.1 免疫组化检测脑组织内Cx47的表达：对照组手术后1 d Cx47在脑组织中即有表达，并随日龄增加染色呈大量棕黄色（图3A、3B、3C、3D），随着日龄增加Cx47表达量也增加；HI组手术后1、3、7、14 d脑组织中Cx47表达虽呈上升趋势，但相同时间点的表达均较对照组明显减少。手术后3、7 d Cx47的表达减少尤为明显（图3F、3G）；而在14 d 2组Cx47表达差异开始缩小（图3H）。

图3 免疫组化检测脑组织内Cx47的表达× 200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Cx47 expression in brain tissue × 200

2.4.2 免疫组化MBP的定位及表达：对照组及HI组手术后1 d脑室周围白质MBP阳性细胞表达较少，随着日龄的增加其表达升高。14 d时MBP广泛表达于OLs胞质及轴突突起上，半定量结果显示HI组MBP的表达较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对照组手术后1、14 d脑组织MBP表达随着日龄增加而增加，由1 d的胞质表达到14 d的广泛细胞间隙突起的表达。HI组MBP的表达趋势与对照组相同，但相同时间点较对照组表达降低，HI组细胞突起明显减少。见图4。

2.5 新生大鼠脑组织中Cx47蛋白表达（表2、图5）

通过Western blotting检测脑组织中Cx47的蛋白表达水平，发现Cx47蛋白表达在对照组及HI组均随着日龄的增长逐步增加（P＜ 0.01）。但2组间比较，HI组手术后3、7、14 dCx47蛋白水平较对照组明显减少（P＜ 0.01）。

图4 免疫组化定位MBP的表达× 200Fig.4 Immunohistochemical detection of MBP expression × 200

表2 2组Cx47蛋白和mRNA表达水平比较Tab.2 The expression levels of Cx47 protein and mRNA in the two groups

图5 各组手术后脑组织Cx47蛋白表达Fig.5 Expression of Cx47 protein in brain tissue after surgery

2.6 脑组织Cx47基因表达水平

实时PCR检测脑组织Cx47mRNA表达水平，发现对照组和HI组在术后第1天即出现Cx47mRNA表达，并随着日龄增加Cx47mRNA水平逐渐增加（P＜0.01）。对照组Cx47mRNA出现高表达先快后慢，直到术后14 d达到高峰（P＜ 0.01）。2组间比较，HI组Cx47mRNA的表达水平在1、3、7、14 d均较对照组明显降低（均P＜ 0.01）。见表2。

3 讨论

OLs的主要功能是包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助神经电信号的跳跃式高效传递，维持和保护神经元的正常功能。而PVL的主要病理改变就是OLs的弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍［12］，OLs对HI高度敏感，HI时未成熟OLs易受到氧化应激等损伤，导致其坏死以及成熟分化障碍。损伤后的OLs不能包裹轴突形成髓鞘，进而导致PVL的发生［7，17］。

缝隙连接可以直接连接相互耦联细胞的胞质，参与细胞间物质、能量交换和信息传递［12，18］。近几年来CJIC作为新兴的膜蛋白通道被广泛关注，在脊椎动物中几乎所有分化细胞都是通过缝隙连接来交流的，包括血红细胞、精子、成人骨骼肌、心肌、平滑肌细胞、胃肠道上皮细胞、脑神经细胞等［19］。中枢神经系统的多种疾病（脱髓鞘疾病、癫痫、胶质瘤、脑缺血缺氧性损伤等）均证实与GJIC有关［20］。缝隙连接蛋白是由多基因家族编码的一大类膜蛋白，在哺乳动物中发现有15种。其中Cx47表达于少突胶质细胞的髓鞘，Cx47基因突变会引起MBP的表达降低，从而导致脑白质异常损伤的脱髓鞘疾病［13，21］。

本研究结果表明，新生大鼠受到HI损伤后会出现行为、运动、发育等方面的异常表现。大脑组织病理显示随着损伤的加重脑组织出现细胞凋亡坏死，脑组织筛网状及空洞形成，进而形成软化。在透射电镜下看到正常脑组织OLs间缝隙连接呈现连续致密的连接，细胞间通道关闭状态，而受到HI损伤后OLs间呈间断不连续的缝隙连接。与对照组比较，HI组脑组织中Cx47表达从术后1 d开始较对照组减少，2组间差异随HI时间延长而更加明显。同时免疫组化检测发现HI组脑组织中MDP表达也较对照组减少。Cx47广泛存在于OLs和髓鞘中，在髓鞘形成早期的发展过程中参与新髓鞘的形成［12］，HI后脑组织中Cx47表达下降与OLs及髓鞘损伤一致，甚至比髓鞘损伤出现更早，这表明在HI致新生大鼠PVL中Cx47的表达下调可能引起OLs的损伤及髓鞘化障碍，从而导致髓鞘的发育延迟。

综上所述，HI条件下新生大鼠髓鞘发育成熟障碍，OLs间缝隙连接开放，脑组织中Cx47表达减少，提示Cx47可能对GJIC功能起到调控作用，并影响髓鞘发育。其具体作用机制有待进一步探索，并可能成为PVL治疗的新靶点。