杨永锋，张子颖，刘国顺，张书伟，杨欣玲，殷全玉，孙溢明，于建春*

1. 河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室 河南省生物炭工程技术研究中心，郑州市文化路95 号 450002 2. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街8 号 450000

烟草种植是一种产质量并重的农业生产过程。部分烟叶产区多年连作、不合理施用化肥导致植烟土壤微生物种群失衡、生物活性降低［1-2］。生物炭（Biochar）是由生物有机物料（生物质）在高温、缺氧或低氧条件下裂解形成的一种含碳量极高的产物［3］，具有较好的物理结构和耐降解等特点［4-6］。高碳基肥料是以生物炭为主要原料的有机肥，近年来在植烟土壤改良中应用广泛。常栋等［7］研究表明，在烟田土壤中施用生物炭基肥料可提高土壤肥力、同时提高植烟土壤微生物的碳源利用能力及其功能多样性。张志浩等［8］研究发现，施用高碳基肥料能够调节植烟土壤理化性质及微生物群落结构，同时还有促进烤烟生长、改善烤后烟叶品质的作用。木霉属（Trichoderma spp.）真菌在自然界中广泛存在且能够与土壤、植物根系及叶面相互作用［9］，已被作为生物防治剂用于植物病害的生物防治［10］，在20 世纪90 年代已用于农业生产中［11］。绿色木霉（Trichoderma viride）作为一种生防菌剂，其拮抗作用表现出广谱抗病和机制多样的特点［12］。有研究表明，绿色木霉在拮抗病原菌［13-14］、防治植物病害［15-16］及促进作物生长发育［17］方面有良好效果。绿色木霉在烟草生产上的应用也较为广泛，王革等［18-19］研究表明，绿色木霉能在烤烟叶面及根部定殖，通过生长竞争、分泌抗菌素类物质及寄生作用可拮抗烟草赤星病菌，提高烤烟抗病性及土壤养分利用率；端永明等［20］研究发现，叶面喷施绿色木霉能够提高烤烟烟苗素质、促进烤烟田间的生长发育且对烟草野火病、黑胫病的防治效果较好。但由于绿色木霉的生长与繁殖受环境因素影响较大［21］，其单独施用的效果并不稳定，而高碳基肥料中的有机物料能够为微生物的生长繁殖提供可直接利用的养分［7,22］，其中生物炭的多孔结构也可为微生物提供良好的栖息环境［23］。因此，微生物制剂配施生物炭有机肥的研究在烟草生产上具有重要意义。目前，生物炭及其有机肥在烟草上的研究多集中在植烟土壤保育方面，对绿色木霉在烟草上的研究多涉及病害生物防治，而对于两者的配合施用研究较少。为此，通过田间试验研究了高碳基肥料配施绿色木霉对烤烟品质的影响，旨在为生物炭有机肥配施微生物制剂在烟草生产上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验基本情况

于2015 年在河南省许昌县（北纬34°01′，东经113°49′）河南农业大学现代烟草农业科技园进行田间试验。该产区属北暖温带季风气候，季节分明，年平均气温14.6 ℃，平均日照总时数2 282 h，年降雨量1 000～1 100 mm，无霜期220～240 d。

1.2 试验材料

供试土壤类型为淋溶褐土，试验地为1 年休闲地，土壤肥力均匀。土壤理化性状：有机质13.47 g·kg-1，碱解氮132.47 mg·kg-1，速效磷10.11 mg·kg-1，速效钾137.5 mg·kg-1，pH 7.77。供试烤烟品种为中烟100。高碳基肥料（河南惠农土质保育研发有限公司）是一种以生物炭为主要原料的有机肥，主要养分N≥2%，P2O5≥1%，K2O≥2%。其中：生物炭≥200 g·kg-1、有机质为45%（有机质来源为芝麻饼）；烟草专用复合肥（N≥10%，P2O5≥10%，K2O≥20%）；硫酸钾（K2O≥50%）、重过磷酸钙（P2O5≥44%）和过磷酸钙（P2O5≥15%）。绿色木霉（Trichoderma viride）制剂为可湿性粉剂由河南农业大学烟草学院提供，有效孢子数3×108个·g-1。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

设置4 个处理：常规施肥（CK）；施用绿色木霉制剂（T1）；施用高碳基肥料（T2）；高碳基肥料配施绿色木霉（T3）。每处理重复3 次，随机区组排列，小区面积95 m2，行距1.2 m，株距0.5 m。烟苗于5 月12 日移栽，纯氮用量45 kg·hm-2，各处理总施氮量相同，N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，肥料用量见表1。具体施肥方法：CK、T1、T2 处理按表1 中的肥料用量混匀后于移栽前1 d 条施；绿色木霉制剂单独灌根施用，将绿色木霉制剂与水均匀混合，混合后水溶液质量体积比为8.33 g·L-1，将混合液在烟苗移栽后1 周灌根施用，每株烟苗混合液用量为20 mL；绿色木霉制剂与高碳基肥料配施时，于起垄前1 周将绿色木霉制剂和高碳基肥料均匀混合后单独条施，混合后肥料中绿色木霉制剂含量（质量比）为0.2%，T3 处理的其他肥料于起垄前1 d 混匀，与高碳基肥料分行条施。其他栽培及田间管理措施按当地优质烟叶生产技术规范进行。

表1 不同处理的肥料用量Tab.1 Amount of fertilizer and Trichoderma viride applied in different treatments （kg·hm-2）

1.3.2 取样方法

烟株打顶后，自下而上第13 位叶片（去除底部1～2 片无效叶片）进行挂牌标记，烤烟成熟收获后按处理及小区将烤后烟叶分开，每小区取挂牌标记的烤后烟叶2 kg，去除烟梗后置于ZZSY-2150型电热鼓风干燥箱（郑州生元仪器有限公司）中在45 ℃条件下烘干至恒质量，碾碎后过筛（筛网孔径0.25 mm），保存，备用。

1.3.3 测定指标与方法

按照YC/T 176—2003［24］方法测定烤后烟叶石油醚提取物含量（质量分数）；按照YC/T 202—2006［25］方法测定绿原酸、芸香苷和莨菪亭含量（质量分数）并计算总量；参照周辉等［26］的方法测定非挥发性有机酸和高级脂肪酸含量（质量分数）；采用内标法测定中性致香物质含量（质量分数），以硝基苯为内标，仪器为HP 5890-5972 气质联用仪（美国Agilent 公司），前处理及GC/MS 分析条件参照韦凤杰等［27］的方法进行，由GC/MS 鉴定结果和NIST库检索定性，结果为3次重复测定的平均值。

1.4 数据处理

采用Excel 2013 进行数据处理，SPSS 22.0 软件进行方差分析，Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对烤烟石油醚提取物及多酚类物质含量的影响

如表2 所示，T2 和T3 处理烤后中部叶石油醚提取物含量比对照（CK）分别显著提高11.11%和27.51%，T1 处理与对照间差异不显著。T3 处理中部叶石油醚提取物含量比T1 和T2 处理显著提高，增幅分别达到20.30%和14.76%。

T3 处理中部叶绿原酸含量显著高于对照，提高43.84%，而对照、T1 和T2 处理间的差异不显著。T2 和T3 处理中部叶莨菪亭含量均显著高于对照，增幅分别为41.38%和20.69%，而对照与T1处理间的差异不显著。各处理中部叶芸香苷含量以T3 处理最高，为9.98 mg·g-1，比对照提高79.17%，T2 处理亦显著高于对照，T1 处理与对照间的差异不显著。各处理中部叶多酚物质总量与芸香苷含量的变化规律基本一致，其中T3 处理比对照提高53.76%。

表2 不同处理对烤后中部叶石油醚提取物及多酚物质含量的影响①Tab.2 Effects of different treatments on contents of petroleum extracts, chlorogenic acid, scopoletin, rutin and total polyphenols in cured middle leaves

2.2 不同处理对烤烟有机酸含量的影响

如表3 所示，T2 和T3 处理中部叶苹果酸含量比对照分别显著提高31.71%和10.92%，而T1 处理低于对照，且差异不显著。T1、T2 和T3 处理中部叶柠檬酸含量均低于对照，其中T2 和T3 处理分别比对照降低10.63%和29.82%，T1 处理与对照差异不显著。T3 处理中部叶草酸含量比对照降低19.46%，T1 处理与对照间差异不显著。T3 处理中部叶棕榈酸含量显著高于其他处理，而其他处理间差异不显著。T1、T2 和T3 处理中部叶油酸含量均低于对照，T3 处理比对照降低26.61%。各处理中部叶丙二酸、硬脂酸、亚油酸含量间差异均不显著。

表3 不同处理对烤后中部叶有机酸含量的影响Tab.3 Effects of different treatments on organic acid contents in cured middle leaves （mg·g-1）

2.3 不同处理对烤烟中性致香物质含量的影响

不同处理烤后中部叶中性致香物质种类和含量分析结果见表4。与对照和T1 处理相比，T2 和T3 处理中部叶28 种香气物质总量均有所提高。烤后烟叶中共检测出18 种类胡萝卜素降解产物，T3 处理中部叶类胡萝卜素降解产物总量最高，比对照提高25.17%。β-大马酮、β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、法尼基丙酮、巨豆三烯酮等致香物质含量与对照相比有所提高。T2 处理中部叶类胡萝卜素降解产物总量显著高于对照，增幅达到10.03%，T1 处理与对照间差异不显著。

4 类芳香族氨基酸裂解产物及其总量均以T3处理最高，芳香族氨基酸裂解产物总量比对照增加48.94%。T2 处理中部叶芳香族氨基酸裂解产物总量比对照提高28.45%，T1 处理与对照间差异不显著。如表4 所示，T3 处理茄酮含量达到60.50µg·g-1，比对照、T1 和T2 处理分别增加46.88%、43.23%和13.64%，差异均达到显著水平。T2 处理茄酮含量比对照显著提高29.25%，而对照和T1 处理间茄酮含量差异不显著。

各处理中部叶棕色化反应产物总量以T3 处理最高，比对照显著提高21.70%，主要表现为糠醛、5-甲基糠醛、β-环柠檬醛含量比对照有所提高。各处理的中部叶棕色化反应产物中均以糠醛含量最高，T3 处理糠醛含量为17.02 µg·g-1，比对照和T2 处理分别提高18.61%和10.66%，T2 处理糠醛含量比对照增加7.18%，对照与T1 处理糖醛含量相近。T2 处理棕色化反应产物总量比对照显著提高11.95%，T1 处理与对照相比有所增加，但处理间差异不显著。

表4 不同处理对烤后中部叶中性致香物质的影响①Tab.4 Effects of different treatments on aroma components in cured middle leaves （μg·g-1）

表4（续）

T3 处理新植二烯含量比对照、T1 和T2 处理均有显著提高，增幅分别为37.78%、37.38%和26.76%；T2 处理新植二烯含量比对照亦有显著提高，而对照与T1 处理间差异不显著。各处理除新植二烯外中性致香物质总量均以T3 处理最高，显著高于其他处理，比对照增加32.06%；T2 处理除新植二烯外中性致香物质总量比对照提高16.66%。T3 处理中性致香物质总量达到1 081.15µg·g-1，比对照、T1 和T2 处理均有显著提高，增幅分别为36.77%、35.73%和24.22%；T2 处理中性致香物质总量比对照增加10.11%，对照和T1 处理间中性致香物质总量差异不显著。

3 讨论

3.1 高碳基肥料配施绿色木霉条件下烤烟中部叶石油醚提取物含量的变化

采用高碳基有机肥料与绿色木霉制剂配施比常规施肥烤烟中部初烤烟叶中的石油醚提取物含量显著提高，可能与绿色木霉分泌的纤维素酶有关。其机制包括诱导烟草体内茉莉酸的合成［28］，进而提高烤烟叶片石油醚提取物及腺毛分泌物含量［29］，以及通过提高烟草细胞中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（HMGR）与倍半萜烯环化酶的活性而促进异戊二烯（IPP，萜类代谢途径起始物）前体物质甲羟戊酸（MVA）的合成［30-31］。施用高碳基有机肥料处理的石油醚提取物含量比常规施肥显著提高，说明高碳基肥料的施用对提高烟叶石油醚提取物含量也有积极作用，这与刘典三等［32］的研究结果基本一致。有研究证实，适量施用钾及微量元素均有利于烟叶石油醚提取物含量的提高［33-34］。在各处理氮素和钾素施用量保持一致的条件下，施用高碳基肥料比常规施肥处理烟叶中石油醚提取物含量显著提高，这可能与高碳基肥料能够提高烤烟对钾的吸收以及植烟土壤微量元素的有效性有关［35-36］。

3.2 高碳基肥料配施绿色木霉条件下烤烟中部叶多酚及有机酸含量的变化

本试验中施用高碳基肥料处理的中部初烤烟叶中莨菪亭、芸香苷及3 种酚类物质总量显著高于对照，这可能与高碳基肥料中的生物炭能提高植烟土壤中硝态氮含量且同时降低铵态氮含量有关［37］，室内和田间试验均表明在高硝态氮环境中生长的烟株比在高氨态氮环境中生长的烟株多酚含量提高［38-39］。高碳基肥料配施绿色木霉处理的3 种酚类物质及其总量均显著高于施用高碳基肥料的处理，这可能与绿色木霉生物肥料能通过增加土壤中铵氧化古菌（AOA）和铵氧化细菌（AOB）丰度来增强其硝化作用，进而提高土壤中硝态氮含量有关［40］。除此之外，绿色木霉能提高烟草苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［30］，而PAL 是烟草多酚合成代谢主要途径——莽草酸途径的关键酶之一［41］，这可能是本试验中采用配施处理的酚类物质及其总量均显著高于单施高碳基肥料处理的原因之一。

本研究中施用高碳基肥料处理比对照烟叶中苹果酸及非挥发性有机酸总量提高，而柠檬酸和草酸含量较低，这与许娜等［42］的研究结果基本一致。高碳基肥料配施绿色木霉处理的烟叶中苹果酸、棕榈酸及有机酸物质总量高于其他3 个处理，而柠檬酸、草酸与亚油酸含量降低，这可能与绿色木霉施用能够促进植物对钾的吸收［43］，提高烤烟对钾肥的利用率有关［19］，有研究表明，钾含量较高的烟叶亚油酸、柠檬酸含量较低，苹果酸及非挥发性有机酸总量较高［44］。

3.3 高碳基肥料配施绿色木霉条件下烤烟中部叶中性致香物质含量的变化

本试验中施用高碳基肥料比常规施肥烤烟中部叶胡萝卜素类降解产物总量及新植二烯含量显著提高，这与高碳基肥料中的生物炭能够提高烤烟叶片中类胡萝卜素和叶绿素含量有关［45］，但其作用机制尚不明确；国内外研究均证实绿色木霉能提高植物叶片中类胡萝卜素和叶绿素含量［13,19,46］，也有研究表明，绿色木霉分泌的纤维素酶能使烟草叶片中挥发性新植二烯含量大幅提高［28］，而高碳基肥料配施绿色木霉比对照和施用高碳基肥料烤烟中部叶胡萝卜素类降解产物总量及新植二烯含量均显著提高，可能与此有关。高碳基肥料配施绿色木霉与其他施肥措施相比烤烟中部叶中性致香物质总量显著提高，这表明该配施措施能够提高烟叶香气量。

本试验中单施绿色木霉对烤烟中部叶相关指标无显著影响，表明尽管在移栽后1 周施用绿色木霉，但条施的化肥可能仍在烟株根际周边集中，进而对绿色木霉的定殖或生长繁殖产生抑制，这与前人研究结果基本一致［47］。本试验中配施措施与单施绿色木霉相比多项指标均有显著差异，表明采用配施措施后绿色木霉的有效性提高，也说明该配施措施受化肥的影响小，绿色木霉的存活率提高，因此配施措施对烤烟香气相关指标的提高效果较为显著。

4 结论

在河南许昌烟草农业科技园，以中烟100 作为栽培品种的条件下：①采用高碳基肥料与绿色木霉配施的施肥措施能够显著提高烤后中部烟叶的香味前体物质、潜香成分含量，如石油醚提取物、多酚类物质、有机酸等。②采用高碳基肥料与绿色木霉配合施用后，初烤中部叶多种中性致香成分明显提高，如类胡萝卜素类降解产物、棕色化反应产物、新植二烯等。③施用高碳基肥料后烤后中部烟叶的石油醚提取物、多酚类物质及中性致香成分含量显著提高。④采用常规施肥基础上仅施用绿色木霉制剂对烤后中部叶致香成分相关指标影响不显著。