胡 栋，孙 通，应义斌,2※

（1. 浙江农林大学工程学院，杭州 311300；2. 浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058）

0 引 言

近年来，有关生物组织光学特性的研究得到了越来越多的关注。究其原因，主要是光学特性测量，包括吸收系数和约化散射系数，有助于研究光与生物组织的互作过程，揭示光学特性参数与理化特性、微观组织结构的关联机制，从而解析光学传感技术的检测机理，为食品和农产品的品质安全无损检测提供理论依据[1-3]。常用的光学特性测量技术有积分球、时域、频域、空间分辨和结构光反射成像（也称为空间频域成像）[4]。例如，Zhang等[5]采用单积分球技术结合反向倍增算法，测量了蓝莓组织在可见/近红外波段的光学特性，根据约化散射系数的变化规律对损伤果实进行识别。Vanoli 等[6]采用时域反射光谱技术对苹果组织的光学特性进行测量，结合线性判别分析对内部褐变果实进行识别，结果表明：褐变果实的吸收系数增大，约化散射系数减小，在波长780 nm 对健康果实和褐变果实的检测准确率分别达到90%和71%。Huang 等[7]采用空间分辨技术测量了600 个西红柿的光学特性参数，结合偏最小二乘法对果实理化指标（硬度、可溶性固形物含量和pH 值）进行回归分析，结果表明：吸收系数和约化散射系数的乘积具有最好的预测效果，3个指标的回归系数分别达到0.923、0.623 和0.769。为了简化问题，学者们通常将生物组织视为单层的均匀结构。但是，大多数的水果（如蓝莓、苹果、西红柿）都是由果皮和果肉两层甚至多层性质各异的组织组成的，忽视果皮的存在将会给测量结果带来误差。同时，测量果皮的光学特性也有助于检测位于果皮部位的缺陷与病害。因此，有必要将水果组织视为双层结构进行研究，分别测量果皮和果肉组织的光学特性参数。

多年来，学者们提出了不同的理论模型用于测量双层组织的光学特性参数[8-11]。这些模型大多基于光传输理论，结合不同的参数拟合算法，从漫反射信号中反演每层组织的吸收系数和约化散射系数。然而，这些模型大多属于点测量，即每次测量只能得到一个像素点的光学特性参数，无法同时获取组织光学特性参数的二维及三维分布，在表征生物组织异质性方面存在不足。

结构光反射成像，作为一种较新的光学技术，通过获取组织表面的反射信号得到检测对象在不同频率、不同相位下的图像，解调后得到随频率变化的漫反射图像，结合相应光传输模型（如漫射近似理论、蒙特卡洛）进行参数反演，可得到组织的二维及三维吸收系数和约化散射系数分布图[12]。该技术最早由Cuccia 等于2005 年引入生物医学领域[13]，并在过去的10 多年中被广泛应用于生物组织的光学特性参数测量[14-16]。近年来，相关学者尝试用该技术测量双层组织的光学特性参数。Weber 等[10]利用结构光反射成像技术测量了自制双层光学仿生样本和人体前臂组织的光学特性参数；Saager 等[17]利用空间调制定量光谱测量高散射皮肤的首层组织厚度和发色团浓度；Yudovsky 等[18-19]利用双层结构光反射光谱结合人工神经网络，成功对表皮中黑色素的吸收作用和真皮中血液的吸收作用进行区分，并且测量得到了表皮的光学厚度和真皮的吸收系数及约化散射系数。虽然结构光反射成像技术在生物医学领域得到了广泛应用，但该技术在农业领域尚处于起步阶段，针对农产品双层组织进行光学特性参数测量的研究更是处于空白阶段。另外，到目前为止，准确测量双层组织的光学特性仍然存在很大挑战；特别是对于次层组织，测量难度更大。这是因为双层模型远比单层模型复杂，测量中会涉及更多的未知变量和影响因素。前期研究表明[20]，基于结构光反射成像技术的分步方法能提高双层组织光学特性参数的测量精度。

基于以上分析，该文采用基于结构光反射成像技术的分步方法测量双层水果组织的光学特性参数，并将其与单积分球技术的测量结果进行比较，具体的研究目标为：1）测量水果果皮和果肉组织的吸收系数和约化散射系数；2）分析结构光反射成像技术和单积分球技术测量组织光学特性参数存在差异的原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用苹果、猕猴桃和芒果3 种常见水果，其中苹果和猕猴桃的果皮厚度较小，芒果果皮厚度相对适中。分别挑选15 个和5 个颜色和尺寸相似的苹果和猕猴桃样本用于试验，挑选5 个尺寸相似的芒果样本，果皮颜色从青色到红色各不相同，如图1 所示。所有样本在试验前用去离子水清洗并擦拭表面，然后贮藏于4℃的冷库中，并在试验前12 h 将其存放于20℃室温下。试验水果样本的品种、直径、质量、果皮厚度和硬度等物理属性详见表1。需要指出的是，表1 中5 个芒果的硬度平均值±标准差为（53.40 ± 26.65）N，表明5 个芒果样本的硬度差异明显。果皮的厚度通过破坏性方法测得：切取约30 mm×30 mm 的样本组织，去除附着在果皮上的果肉组织，用千分尺测量5 次后取平均值。

图1 试验样本 Fig.1 Test samples

1.2 结构光反射成像系统

结构光反射成像系统的示意图如图2 所示[16,21]，主要包括卤钨灯光源及其控制器（Oriel Instruments，USA）、投影仪（DLi CEL5500-Fiber，Digital Light Innovations，USA）、高性能CCD 相机（PhotonMAX 1024B，Princeton Instruments，USA）、定焦镜头（35 mm，Edmund Optics Inc.，USA）和液晶可调谐滤波器（Liquid Crystal Tunable Filter，LCTF，Cambridge Research and Instrumentation，Inc.，USA）。相机与投影仪前端装有线性偏振片（Edmund Optics Inc.，USA），用于减小样本表面的镜面反射，提高图像采集质量。LCTF 的波长范围为650～1 000 nm，光圈大小和带宽分别为20 mm 和10 nm，波长调节精度为（1.5±0.5）nm。通过MATLAB 生成不同频率、不同相位的正弦图案，将其导入与投影仪配套的软件中，控制投影仪产生结构光照射在样本表面，CCD 相机采集漫反射图像并实时保存于计算机中。CCD 相机的参数设置、图像采集和LCTF 的波长调节均通过LabVIEW 软件实现。

表1 试验样本的物理属性 Table 1 Physical properties of test samples

图2 结构光反射成像系统示意图 Fig.2 Schematic of structured illumination reflectance imaging system

结构光反射成像系统标定通过测量并比较光学特性参数已知的双层样本的结果实现。双层样本以固体仿生样本为首层组织，以不同浓度的牛奶为次层组织。固体仿生样本由实验室自行设计制作完成[22]，以聚氨酯为基底，染料和印度墨水为吸收剂，TiO2为散射剂。固体仿生样本和牛奶组织的光学特性参数均通过单积分球方法进行标定测量。该标定样本的首层组织厚度小于2 mm，满足基于结构光反射成像的分步法反演双层组织光学特性参数的前提条件[20]；次层组织厚度大于50 mm，满足漫射近似理论的“半无限”几何要求[23]。

波长选择通过调节LCTF 实现。受投影仪输出功率的限制，830～1 000 nm 的信号强度较弱，在本研究中不适用。图3 为不同样本在650～870 nm 的表面反射强度对比图。从图中可以看出，随着波长的增大，校正白板的信号强度先增大后减小，在730 nm 处达到最大，830 nm处的反射信号强度与650 nm 相近，这是因为投影仪在830 nm 以上输出功率较弱。标定样本、苹果、猕猴桃和芒果的平均反射信号强度变化规律与校正白板大体一致。但是，水果的反射信号强度在650～690 nm 普遍较弱，在670 nm 左右达到最小，这是因为水果组织中的叶绿素在这个波长范围对光有很强的吸收作用[6]；当波长大于830 nm时，水果组织的反射信号强度变化不大。650～690 nm 是水果的特征波段，675 nm 左右的叶绿素吸收峰对光学特性参数测量有较大的参考意义。因此本研究选择的有效波长范围为650～830 nm，波长间隔为20 nm，共计10 个波长。

图3 校正白板和不同双层样本组织在650～870 nm 的表面反射强度 Fig.3 Signal intensity for the calibration plate and two-layered samples in the spectral range of 650-870 nm

1.3 光学特性参数测量

当平面结构光垂直入射到介质表面时，由稳态下的漫射近似理论及施加的边界条件，可推导得到单层和双层介质表面漫反射R1( fx)和R2( fx)的表达式分别为[12,24]

式中A1、A2和A3均为常量，可通过求解边界条件得到，下标1 表示首层组织。以上表达式的具体推导过程可参考已发表文献[1,20]。通过式（1）和式（2），结合相应的参数拟合算法，可反演得到双层组织每一层的光学特性参数。

单积分球技术结合反向倍增（Inverse Adding Doubling，IAD）算法可作为参考方法用于测量生物组织的光学特性参数。通过测量样本的全反射和全透射值，单积分球技术能得到µa和µs´；它不受漫射近似理论的近似特性和前提条件等因素限制，理论上能用于测量任何类型样本的光学特性参数。但是该技术需要对样本进行有损切片处理，样本准备过程较为复杂。单积分球系统的具体布置、全反射和全透射的测量步骤详见实验室已发表的论文[25-27]。

图4 为水果（苹果、猕猴桃和芒果）果皮和果肉组织的光学特性参数测量流程图。光学特性的测量值用结构光反射成像技术测得，需要经过图像采集、图像解调和参数拟合等步骤；参考值用单积分球系统采集光谱，结合反向倍增算法计算得到，其中样本的果皮和果肉需要切片后分别测量。水果的结构光反射图像采集区域尽量选择表面面积较大的平整区域。结构光反射成像技术测量组织光学特性参数的分步方法的基本思路为[28]：首先用较大的空间频率（光透射深度较小）结合单层模型1反演首层组织的光学特性参数；在获得后，将它们和首层组织厚度d 值作为已知量，用较小的空间频率（光透射深度较大）结合双层模型2 反演次层组织的光学特性参数

图4 水果果皮和果肉组织的光学特性参数测量流程图 Fig.4 Flowchart of optical properties measurement for skin and flesh of fruits

2 结果与分析

2.1 系统标定结果

结构光反射成像技术测量双层样本光学特性参数的实验结果（表2）表明：µa1、µs1´、µa2和µs2´（下标1、2 分别对应首层和次层组织）的测量误差分别小于19%、7%、28%和20%。µs´的测量精度高于µa，且首层组织的测量精度明显高于次层组织，这是因为µs´的绝对值比µa大得多，测量难度较小，而光与次层组织的相互作用要弱于首层组织，因此反射图像所携带的与次层组织相关的有效信息较少。表2 列出了已报导的双层组织光学特性参数测量精度比对情况。从表中可以看出，本文所用方法的测量精度高于Kienle 等[8]，Cen 等[9]和王爱臣[22]用空间分辨方法测量双层组织光学特性参数的结果。Weber 等[10]用结构光反射成像技术测量双层样本首层组织的光学特性参数效果较好，分别达到了17%和2%，但是对于次层组织效果不理想，特别是对于µa2，误差达到了100%。考虑到单积分球技术在测量样本光学特性参数时本身存在一定误差，特别是对于µa，给测量带来了更大挑战。因此，该文所描述的结构光反射成像系统，结合分步方法测量双层组织的光学特性参数是可行的。

表2 双层样本光学特性参数测量精度比较 Table 2 Accuracy comparison on optical properties measurement of two-layered samples

2.2 果皮光学特性

图5 为苹果、猕猴桃和芒果果皮组织的吸收系数和约化散射系数测量结果。可以看出，虽然3 种水果果皮组织的光学特性参数大小不尽相同，但其随波长变化的规律基本一致。具体表现为：1）同种水果的大于µa，因为果皮组织是强散射介质；2）果皮在650～700 nm 波段对光的吸收强烈，670 nm 左右出现了由叶绿素引起的吸收峰，700 nm 之后组织对光的吸收作用急剧减弱并趋于稳定；3）µs´随着波长的增大单调递减或单调递增。Mie 理论指出，µs´随着波长的增大而减小[29]。进一步分析发现，图5 中随波长增大的µs´曲线平滑处理前，在670 nm 左右往往有一个波谷，该波谷由叶绿素对光的强吸收造成；而基于波长的平滑处理能减少拟合噪声，提高曲线拟合精度和稳定性[30]，在光学特性参数反演过程中必不可少。因此该文采用了平滑后曲线，出现了随波长的增大而上升的趋势。从图5c 还可以看出，芒果1 和芒果2 果皮组织的吸收峰值比其他3 个芒果大得多。进一步分析发现，这2 个芒果未完全成熟，果皮呈青绿色（如图1 所示），叶绿素含量较高，因此对光有很强的吸收作用；而其他3 个芒果的成熟度更高，果皮中的叶绿素开始降解，果皮呈青红色甚至深红色，对光的吸收作用减弱，因此吸收峰降低，µa值减小。

图5 苹果、猕猴桃和芒果果皮组织的µa1 和µs1´测量结果 Fig.5 Measured values of µa1 and µs1´ for skin tissue of apple, kiwifruit and mango by using the structured illumination reflectance imaging technique

2.3 果肉光学特性

图6 为苹果、猕猴桃和芒果果肉组织的吸收系数和约化散射系数测量结果。可以看出，果肉组织的光学特性曲线变化趋势与果皮组织大体一致，但也存在不同之处。具体表现为：1）果肉组织的μa和μs′普遍小于果皮组织，且猕猴桃表现地尤为明显。这是因为水果组织对光的吸收作用主要由色素等成分引起，对光的散射作用主要由纤维素、果胶等成分引起[22]，而这些成分在果皮中的含量往往比果肉高。2）猕猴桃和芒果果肉组织吸收系数曲线在670 nm 处的吸收峰有些许移动，这可能是因为猕猴桃的绿色果肉组织紧挨着黑色种子和白色基座组织，这种不均匀性使得果肉组织吸收系数的测量变得更加困难，而芒果的果皮相对较厚，也给测量带来了更大挑战。与王爱臣[22]利用空间分辨技术测量芒果果皮和和果肉组织的光学特性相比，该文的首层组织（果皮）光学特性参数测量结果与其精度相当，而次层组织（果肉）结果更优，精度有了明显提高，特别是µa。

从以上分析可以看出，果皮和果肉组织的吸收系数和约化散射系数与其所含成分密切相关，如色素、纤维素、果胶等。因此，测得的组织光学特性可进一步用于水果品质的无损检测，如颜色、硬度、糖度等，有待于后期进一步研究。

2.4 光学特性参数测量误差分析

图7 为结构光反射成像技术和单积分球技术测量得到苹果果肉组织的光学特性参数和相对误差绝对值。从图中可以看出，2 种方法测量得到的µa2和µs2´值的变化规律基本一致，但是µa2值在650、670 和690 nm 3 个波长下相差较大。这可能是因为：1）用结构光反射成像技术测量µa2的难度要大于其他3 个参数（µa1、µs1´和µs2´）；2）果肉组织在这3 个波长对光有很强的吸收作用（如图 6 所示），导致采集到的反射信号较弱，进而给光学特性参数反演带来更大误差。与单积分球技术的测量结果相比，µa2和µs2´在这10 个波长下的平均误差分别为22.8%和4.9%，如果不考虑650、670 和690 nm 这3 个波长，µa2的误差将减小至6.3%。在进行单积分球试验时发现，水果样本在切片后组织表面会发生变化，如被氧化；同时，在用千分尺测量切片样本的厚度时，即使用了多次测量取平均值的方法，厚度的测量依然存在误差。为了探究以上因素对单积分球测量光学特性参数的影响，该文对不同离体时间和不同厚度测量误差的切片样本分别进行了试验。

图6 苹果、猕猴桃和芒果果肉组织的µa2 和µs2´测量结果 Fig.6 Measured values of µa2 and µs2´ for flesh tissue of apple, kiwifruit and mango by using the structured illumination reflectance imaging technique

图7 结构光反射成像技术和单积分球技术测量苹果果肉组织的光学特性参数和相对误差 Fig.7 Optical properties (µa2 and µs2´) and relative error of apple flesh tissue measured by the structured illumination reflectance imaging and single integrating sphere techniques

图8 所示为苹果果肉组织在切片后5、15 和25 min时，用单积分球技术测量得到的µa和µs´结果。可以看出，随着果肉切片组织在空气中暴露时间的增加，µa和µs´值分别有增大和减小的趋势。与5 min 的结果相比，25 min 测量µa和µs´的结果在500～1 000 nm 波长范围内的变化差异平均值分别为27.7%和2.3%（绝对值）。究其原因，主要是因为果肉组织中的酚类化合物，如多元酚类、儿茶酚等，在与空气接触后容易被氧化成醌类化合物[31-32]，促使苹果果肉颜色逐渐由白色变成黄色，而且随着与空气接触时间的延长，参加反应的量变多，颜色也逐渐变深，因此光学特性也发生了相应变化。

图9 所示为厚度的测量误差对离体苹果果肉组织光学特性参数测量的影响，本文考虑了“-20%误差”“-10%误差”“+10%误差”“+20%误差”和“0 误差”5 种情况。从图中可以看出，5 条曲线之间差异明显，说明厚度的精确测量对单积分球技术测量光学特性参数至关重要。进一步分析发现，与“0 误差”下的结果相比，“-20%误差”“-10%误差”“+10%误差”和“+20%误差”下测量得到µa和µs´的全波长平均差异分别为34.8%、16.2%、-14.2%、-27.4%和24.7%、11.2%、-9.1%、-16.7%。以上研究针对果肉组织，而果皮组织的试验结果与其类似，同时果皮的厚度更小，更容易引起测量误差。因此，在用单积分球技术测量组织光学特性参数时，厚度的准确测量至关重要。

图8 单积分球技术测量离体苹果果肉组织的µa2 和µs2´随时间变化情况 Fig.8 Value changes of µa2 and µs2´ with in vitro time for apple flesh tissue measured by the single integrating sphere technique

图9 苹果果肉组织厚度的测量误差对单积分球技术测量µa2和µs2´的影响 Fig.9 Effect of measurement error for apple flesh thickness on estimating µa2 and µs2´ by the single integrating sphere technique

综上所述，结构光反射成像技术与单积分球技术的测量结果存在一定差异，主要由以下因素引起：1）果皮和果肉在切片取样后，光学特性会随着时间的推移发生变化；2）果皮和果肉切片样本的厚度测量误差，以及厚度不均匀性会影响单积分球技术对其光学特性参数的测量精度；3）结构光反射成像和单积分球分别对完整样本和离体组织进行测量，试验对象的差异给试验结果带来影响。

3 结 论

该文采用标定后的结构光反射成像系统结合分步方法测量了苹果、猕猴桃和芒果果皮和果肉组织的光学特性参数，并分析了结构光反射成像技术和单积分球技术测量水果组织光学特性参数存在差异的原因。

1）结构光反射成像技术对双层液体样本首层组织吸收系数、约化散射系数、次层组织吸收系数和约化散射系数的测量误差分别小于19%、7%、28%和20%。

2）苹果、猕猴桃和芒果果皮和果肉组织的吸收系数曲线能反映色素等成分在特定波长的吸收峰，果皮组织的吸收系数和约化散射系数普遍高于果肉组织，且猕猴桃表现地尤为明显。

3）离体切片组织在空气中的暴露时长和切片厚度测量误差均会对单积分球技术测量组织光学特性参数造成不可忽略的影响。

在使用单积分球技术测量农产品组织光学特性参数的过程中，应减少样本准备时间，提高切片样本厚度均匀性和测量精度，以减小上述因素对光学特性参数测量的影响。此外，结构光反射成像作为一种宽屏成像技术，测得的宽场（二维）光学特性为农产品缺陷（如苹果损伤、腐烂）的可视化检测提供了可能。未来研究可将该技术测得的宽场光学特性参数应用于农产品品质安全检测。