王 晴， 钱玉梅， 李红侠， 陈红玲， 曹稳根

(宿州学院生物与食品工程学院, 安徽 宿州 234000)

0 引 言

玉米须是我国传统的药材，含有丰富的多糖，玉米须多糖具有清热、平肝、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抗便秘、提高免疫力等诸多功效[1]，但对玉米须多糖降糖、抑菌作用罕见报道。目前玉米须多糖提取方法有溶剂法、酶法、微波法及超声法等，徐彬等[2]采用水溶醇沉法得到玉米须在最佳工艺下多糖的提取率为3.66%；陈红等[3]用微波协同纤维素酶提取玉米须多糖，通过单因素和正交试验，得到多糖提取率最优值为8.12%；张元薇[4]采用超声辅助酶法提取玉米须多糖，最佳得率为15.53%。酶催化具有高效性和专一性，能提高多糖提取率，比大部分物理提取法效率高，回流提取避免提取液挥发又可节约用量，结合酶解法能高效提取玉米须多糖。以玉米须为原料，采用纤维素酶酶解-回流法提取多糖，探究玉米须多糖酶解-回流提取的最佳条件，并研究了其降糖、抑菌活性，为玉米须多糖的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜玉米须，市售；纤维素酶购于上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶购于美国Sigma公司；阿卡波糖购于拜耳医药保健有限公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均为宿州学院微生物实验室斜面保藏；其他试剂均为分析纯。R-1001LN型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；SP-723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米须多糖酶解粗提液的制备

新鲜玉米须去除杂质，干燥后粉碎过100目筛得玉米须粉末，按料液比1∶50(g/mL)与2%纤维素酶溶液混合，在60 ℃、pH 5的条件下酶解60 min，75 ℃灭酶10 min，冷却后得玉米须多糖酶解粗提液。

1.2.2 玉米须多糖提取率测定

苯酚-硫酸法[5]得葡萄糖标准曲线(Y=64.986X+0.0079，R2=0.9984)，并根据吸光值换算多糖浓度，计算玉米须多糖提取率：提取率(%)=多糖浓度(mg/mL)×稀释倍数×所得提取液体积/玉米须质量×100%。

1.2.3 单因素试验

取新鲜玉米须按1.2.1方法进行酶解，回流温度90℃、回流时间2 h，料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，探究料液比对玉米须多糖提取率的影响；料液比1∶30、回流温度90℃，回流时间0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，探究回流时间对玉米须多糖提取率的影响；料液比1∶30、回流时间2 h，回流温度70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，探究回流温度对玉米须多糖提取率的影响。

1.2.4 酶解-回流提取工艺的响应面优化设计

依据单因素结果，三个因素的低、中、高水平分别用-1，0，1表示，其中0是单因素试验中多糖得率最大值所对应的因素值[4-5]，利用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计并回归优化。

1.2.5 玉米须多糖生物活性研究

参照韩瑨等[6]研究方法，测定玉米须多糖α-葡萄糖苷酶抑制活性；参照雒江菡[7]的方法，采用滤纸片法测量抑菌圈直径，测定玉米须多糖的抑菌活性。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对玉米须多糖提取率的影响

当料液比在1∶10-1∶30间，提取液体积越大，提取率越高，达到1∶30提取率上升到最大值，随后开始下降，故确定在料液比单因素试验中最佳料液比为1∶30 。出现上述现象是由于提取液体积过小使得黏度偏大，导致分子扩散速度慢，阻碍多糖的溶出，随着提取液体积增加，向细胞中扩散量增多使得提取液对多糖的溶解量增大，从而使多糖提取率增加，但提取液体积的继续增大会导致过量的提取液使多糖溶解量达到饱和状态，使得多糖提取率开始下降，且适宜的料液比已将多糖基本溶解出，过大时消耗溶剂量增加，同时去除溶剂负荷增加且期间可能会破坏多糖结构。

2.1.2 回流时间对玉米须多糖提取率的影响

回流时间在0.5～2.0 h间，玉米须多糖提取率随回流时间增加逐渐提高，当回流时间增加到2 h，多糖提取率上升到最大值，随后便开始下降，由此可确定在回流时间单因素试验中最佳值为2 h。出现上述现象是由于在0.5～2 h范围内，随着时间的增加多糖逐渐溶解使得提取率上升，当超过2 h，随着时间继续延长，多糖发生一定程度的分解，使得多糖提取率下降。

2.1.3 回流温度对玉米须多糖提取率的影响

回流温度在70℃～90℃间，回流温度增加玉米须多糖提取率增加， 90℃时多糖提取率最大值，随后便开始下降，因此确定在提取温度单因素试验中最佳值为90℃。出现上述现象原因是当温度低于90℃时，温度的升高有助于提取液分子向细胞中扩散从而提高多糖的溶解量，而温度达到90℃后继续升高，过高的温度使得多糖的稳定性下降甚至造成多糖高温分解，结构破坏，使得多糖的提取率降低。

图1 料液比、回流时间、回流温度对多糖提取率的影响

2.2 响应面法探究最佳工艺条件

2.2.1 因素水平编码与试验

料液比(A)、回流时间(B)、回流温度(C)为自变量，玉米须多糖提取率(Y)为响应值，根据Box-Behnken试验设计进行试验(表1)，得到的结果如下(表2)。

表1 响应面分析因素与水平

表2 响应面分析方案及试验情况

通过Design Expert 8.0软件对试验结果进行二次多项回归拟合，得到的回归方程为：Y=0.11A+0.53B+0.044C-0.80AB+0.13AC-0.28BC-1.36A2-1.09B2-1.64C2+35.02，试验的方差分析如下(表3)。此模型的F值为17.31，p<0.001(p=0.000 5)，表明此模型极其显著，方程中失拟项p>0.05(p=0.657 9)，未达显著水平，表明该方程对试验拟合好，可用其分析和预测实验结果，即本方法可靠。从方差检验可看出，A2、C2对多糖提取率影响极其显著(p<0.001)，B，AB,B2对多糖提取率影响显著(p<0.05)，而A，C，AC，BC对多糖提取率影响均不显著(表3)，由此可见，料液比、提取时间、提取温度对多糖提取率的影响非单纯线性关系。从单因素水平看，对多糖提取率影响顺序：回流时间(B)>回流温度(C)>料液比(A)，两两因素交互作用的影响主次顺序为：AB>BC>AC。

表3 回归模型方差分析

注： “Prob>F”值<0.05,影响显著(<0.001极其显著); 反之, 则不显著

Note: “Prob>F” <0.05 significate(p<0.001 extremely significant); On the contrary, no significant difference

2.2.2 最佳提取条件的确定及验证试验

对所得的回归方程分别对自变量A、B、C求一阶偏导数，并令偏导数等于0，求出极值，即是最大多糖提取率的最优条件：料液比1∶29.7、回流时间2.13 h、回流温度89.95℃，玉米须多糖提取率达35.08%。考虑到操作便捷性，成本大小，最适宜条件调整为料液比1∶30 g/mL、回流时间2 h、回流温度90 ℃，并平行重复3次进行验证试验，得到的平均提取率(35.14±0.02)%和预测值接近，表明了响应面法优化最佳条件的切实可行性。

2.3 玉米须多糖生物活性

2.3.1 玉米须多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的物质能够抑制其对食物中淀粉和糖类的降解，延迟并减少葡萄糖的产生和吸收，从而达到餐后降糖效果[8]。玉米须多糖在浓度较低时即具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且在浓度为1.6 mg/mL时，抑制率达到80%以上且趋于稳定。

2.3.2 玉米须多糖抑菌活性

玉米须多糖对三种细菌均有一定的抑制作用，且抑制作用随玉米须多糖浓度的升高而增强，其中对大肠杆菌的抑制作用高于对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，说明玉米须多糖对革兰氏阴性菌的抑制作用高于革兰氏阳性菌。

图2 玉米须多糖降糖、抑菌活性

3 结 语

玉米须作为一种常用药材，具有多种生物学活性及应用价值，因此对其提取工艺的优化和药理活性的开发具有重要现实意义。纤维素酶酶解玉米须得到玉米须多糖粗提物，以多糖提取率为评价指标进行回流提取，优化得到回流提取最优条件：料液比1∶30 g/mL、回流时间2 h、回流温度90 ℃，得到玉米须多糖提取率为(35.14±0.02)%，与理论值相符，高于课题组前期得到的纤维素酶-超声波法玉米须多糖提取率(27.98±0.17%)和纤维素酶-微波法得到玉米须多糖提取率(31.20±0.50%)。在最优条件下酶解-回流提取玉米须多糖，探究其生物活性，结果表明玉米须多糖能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，减少机体对葡萄糖的吸收，抑制细菌生长，对革兰氏阴性菌抑制效果最好。