雷有娟,孙万成,罗毅皓，马海青，康海燕

(1.青海大学 农牧学院，西宁 810016； 2.青海省祁连县畜牧兽医站，青海 祁连 810499；3.青海省祁连县默勤镇畜牧兽医站，青海 祁连 810499)

牦牛酥油主要成分为脂肪、水分和少量蛋白质，并且含有丰富的微量元素[1]和不饱和脂肪酸。牦牛乳的功能性脂肪酸总量比普通牛乳约高3%[2]，夏季或者秋季从牦牛乳中提炼出的酥油呈鲜黄色，而冬季牦牛酥油则呈奶白色。研究表明[3-4]牦牛酥油功能性脂肪酸含量比原乳丰富，如亚油酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、EPA和DHA。

磷脂(PL)是生物膜的基本组成成分，包括鞘磷脂和甘油磷脂两大类，鞘磷脂主要存在于高等动物组织中，甘油磷脂在动物肝脏、脑及卵巢中含量丰富。目前，PL的分析方法有质谱技术[5-6]，核磁共振光谱法[7-8]，高效液相色谱(HPLC)串联不同的检测器[9-10]，如紫外(UV)检测器、示差折光(RI)检测器、质谱(MS)、蒸发光散射(ELSD)检测器等。脂质组学从2003年提出以来迅速成为研究热点[11-12]，是代谢组学的一个重要研究领域，其研究的技术主要包括脂质的提取、分离、分析鉴定以及相应的生物信息学技术。本实验主要围绕牦牛酥油磷脂的提取，脂肪酸组成分析和脂质组学分析展开研究，以期为牦牛酥油的进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白、黄牦牛酥油购自青海省祁连县野牛沟牧民家；15%三氟化硼甲醇溶液；LC-MS级甲醇、LC-MS级甲基叔丁基醚，CNW Technologies；LC-MS级醋酸铵、LC-MS级氨水、LC-MS级二氯甲烷、LC-MS级异丙醇，默克公司；99%d7-PE、99%d7-LPC、99%d7-TG，Avanti；正己烷、无水乙醇、异丙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氢氧化钾、氯化钠均为分析纯。

Trace DSQ气相色谱质谱联用仪，赛默飞世尔科技公司；1290 UPLC超高效液相色谱仪，Agilent公司；Triple TOF 6600高分辨质谱，AB Sciex；Heraeus Fresco17离心机，Thermo Fisher Scientific；BSA124S-CW天平，Sartorius；明澈 D24 UV纯水仪，Merck Millipore；PS-60AL超声仪；Phenomen Kinetex 1.7u C18 100 A 色谱柱(100 m×2.1 mm)，菲罗门；LC-04C医用离心机；MVS-1旋涡混合器；THZ-82恒温振荡器；JM-B 3003电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛酥油磷脂提取

氯仿-甲醇(2∶1)提取牦牛酥油磷脂采用Folch法[13]。正己烷、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯提取牦牛酥油磷脂工艺为：分别称取5份6 g牦牛酥油于50 mL离心管中，分别加入6倍体积的不同溶剂，45℃下恒温振荡1 h，之后在3 000 r/min下离心10 min,去除下层蛋白质及其他杂质，取上清液在旋转蒸发仪中浓缩油脂，记录油脂质量，之后向提取的油脂中加入丙酮，溶液开始变浑浊时停止加入(丙酮添加量为上清液体积的2～3倍)，振荡均匀后在4℃冰箱中静置约25 h，离心分离出离心管底部粗磷脂后用氮气吹干，得到磷脂产品，于-20℃冷冻保存。按下式计算提取的牦牛酥油中油脂得率和磷脂得率。

1.2.2 脂肪酸组成分析

1.2.2.1 样品甲酯化

取0.5 g样品于具塞试管中，加入10 mL甲醇和1 g氢氧化钾，盖住瓶口，于65℃恒温振荡2 h。取出冷却后，加入浓盐酸酸化至pH 2～3，再加入10 mL 正己烷，振荡均匀，静置10 min待其分层，取正己烷层(上层)于另一干燥试管中，氮气吹干正己烷获得游离脂肪酸。加入质量分数为15%的BF3-CH3OH 1 mL，90℃水浴2 h；取出冷却后，移入离心管中，加2 mL正己烷，振摇，3 500 r/min离心 2 min，取正己烷层氮气吹干，待GC-MS分析。

1.2.2.2 GC-MS条件

DB-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升温条件：初始温度60℃，保持1 min；以 10℃/min升温至180℃，以4℃/min升温至280℃，保持10 min；以20℃/min升温至300℃，保持2 min。载气为高纯He(99.999%)，进样口温度280℃，进样量1.0 mL/min，传输线温度285℃；离子源温度250℃；溶剂延迟时间7 min；质量扫描范围(m/z)40～550。

1.2.3 牦牛酥油以及磷脂UHPLC-QTOF-MS脂质组学分析

1.2.3.1 样品处理

取10 mg样品，加入400 μL H2O、960 μL甲基叔丁基醚-甲醇(MTBE-MeOH，体积比5∶1，含9 μL 10 mg/kgd7-PE(15∶0/18∶1)、9 μL 10 mg/kgd7-LPC(18∶1)、9 μL 100 mg/kgd7-TG(15∶0/18∶1/15∶0)。涡旋60 s，超声10 min后在4℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液500 μL；重新加入500 μL MTBE-MeOH，涡旋60 s，超声10 min后继续在4℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液500 μL；再次加入500 μL MTBE-MeOH，涡旋60 s，超声10 min，4℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液500 μL。合并3次上清液后旋干，用200 μL二氯甲烷-甲醇(DCM-MeOH，体积比1∶1)复溶，将上清液稀释20倍。取75 μL上清液于2 mL进样瓶，待UPLC-MS检测。

1.2.3.2 UPLC-MS分析条件

流动相A为10 mmol/L HCOONH4(甲酸铵)-40% H2O-60% ACN(乙腈)，流动相B为10 mmol/L HCOONH4-10% ACN-90% IPA(异丙醇)，梯度洗脱程序见表1，进样量 2 μL。轰击能量35 eV，每50 ms 15张二级谱图。ESI离子源参数：雾化气压(GS1)60 Pa，辅助气压60 Pa，气帘气压30 Pa，温度550℃，喷雾电压-4 500 V。AB 6600 Triple TOF质谱仪能够在控制软件(Analyst TF 1.7，AB Sciex)控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。

表1 UPLC流动相梯度洗脱程序

1.2.3.3 数据处理

使用ProteoWizard软件将质谱转成mzXML格式，再使用XCMS软件进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，minfrac设为0.5，cutoff设为0.6。使用XCMS软件、R程序包及脂质二级数据库进行脂质鉴定，再根据加入的内标物质量浓度及其峰面积、各脂质物质峰面积以及RF数据代入相应的公式计算样品中脂质物质含量。

2 结果与分析

2.1 牦牛酥油的油脂得率及磷脂得率

不同溶剂提取的牦牛酥油中油脂得率如图1所示。

注：不同字母表示均值间有显著性差异(p<0.05)。下同。
图1 不同溶剂提取牦牛酥油中油脂得率的比较

从图1可以看出：正己烷、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇5种溶剂提取牦牛酥油中的油脂得率不同，黄酥油中油脂的含量高于白酥油，黄酥油油脂得率依次为正己烷>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>异丙醇>乙醇，其中正己烷提取的油脂得率最高，达88.86%，乙醇提取的最低，白酥油油脂得率依次为正己烷>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>异丙醇>乙醇，其中正己烷提取的油脂得率最高，达84.32%，乙醇提取的最低。

不同溶剂提取牦牛酥油的磷脂得率如图2所示。

图2 不同溶剂提取牦牛酥油中磷脂得率的比较

从图2可以看出：正己烷、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇5种不同溶剂提取牦牛酥油中磷脂得率也不同，黄酥油中磷脂含量略高于白酥油，黄酥油磷脂得率依次为正己烷>异丙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>乙醇，其中正己烷提取的磷脂得率最高，达12.27%，乙醇提取的最低，白酥油磷脂得率依次为正己烷>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>异丙醇>乙醇，其中正己烷提取的磷脂得率最高，达11.28%，乙醇提取的最低。

2.2 牦牛酥油以及磷脂的脂肪酸组成(见表2)

表2 牦牛酥油及不同溶剂提取牦牛酥油磷脂脂肪酸组成及相对含量 %

脂肪酸白酥油不同溶剂提取白酥油磷脂脂肪酸相对含量乙酸乙酯乙醇异丙醇正己烷氯仿-甲醇黄酥油不同溶剂提取黄酥油磷脂脂肪酸相对含量乙酸乙酯乙醇异丙醇正己烷氯仿-甲醇C22∶000.8101.3900.9601.3501.8601.8100.5000.9301.7200.7001.6901.91C22∶600.16NDNDNDNDND00.07NDNDNDNDNDC23∶000.3900.6500.4501.2801.2300.82ND00.4401.2200.4400.8600.92C24∶000.2900.3500.3100.5900.7700.4900.2100.3900.5700.3200.9100.86C24∶100.05NDNDNDNDND00.04NDNDNDNDNDC25∶000.0500.06NDNDND00.10ND00.04NDNDND00.14C26∶000.07NDNDNDNDND00.10NDNDNDNDNDBCFA09.0607.6907.3404.5109.8507.1905.2804.5904.5003.7909.3105.34MUFA24.0507.5408.1808.9010.0904.8724.2909.1312.2404.1719.5208.51PUFA01.0400.1600.1000.3100.6900.0302.4600.4900.9800.0603.0200.39SFA74.9292.1991.7290.7988.6495.0973.2590.3786.7895.7774.1891.10MCFA03.9600.9101.2100.5701.1701.1505.8801.4000.8600.7603.3601.57LCFA96.0498.9498.7599.3798.2698.8194.1298.5799.1499.2493.1998.41

注：BCFA为支链脂肪酸，MUFA为单不饱和脂肪酸，PUFA为多不饱和脂肪酸，SFA为饱和脂肪酸，MCFA为中链脂肪酸，LCFA为长链脂肪酸(C13以上)，ND表示未检出，iso-表示支链，anteiso表示反式支链，trans表示反式。

从表2可以看出：白酥油中共检出33种脂肪酸，其中饱和脂肪酸22种，不饱和脂肪酸11种，支链脂肪酸6种；黄酥油共检出32种脂肪酸，其中饱和脂肪酸20种，不饱和脂肪酸12种，支链脂肪酸6种。白酥油和黄酥油中饱和脂肪酸含量分别占脂肪酸总量的74.92%和73.25%，不饱和脂肪酸分别占脂肪酸总量的25.09%和26.75%，支链脂肪酸分别占脂肪酸总量的9.06%和5.28%，长链脂肪酸相对含量分别达96.04%和94.12%。

牦牛酥油磷脂中饱和脂肪酸含量最多，其次是单不饱和脂肪脂肪酸，多不饱和脂肪酸含量最少。在同一牦牛酥油样品中，不同溶剂提取的磷脂中脂肪酸含量有显著性差异(P<0.05)，白酥油中MUFA含量从多到少依次为正己烷>异丙醇>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇，黄酥油中MUFA含量从多到少依次为正己烷>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>异丙醇；白酥油中PUFA含量从多到少依次为正己烷>异丙醇>乙酸乙酯>乙醇>氯仿-甲醇，黄酥油中PUFA含量从多到少依次为正己烷>乙醇>乙酸乙酯>氯仿-甲醇>异丙醇；白酥油中SFA含量从多到少依次为氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>异丙醇>正己烷，黄酥油中SFA含量从多到少依次为异丙醇>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>正己烷；白酥油中BCFA含量从多到少依次为正己烷>乙酸乙酯>乙醇>氯仿-甲醇>异丙醇；黄酥油中 BCFA含量从多到少依次为正己烷>氯仿-甲醇>乙酸乙酯>乙醇>异丙醇。5种不同溶剂相比较而言，白酥油和黄酥油中以正己烷为提取剂提取的磷脂中MUFA、PUFA和BCFA含量相对较高，而SFA含量相对较低。

2.3 牦牛酥油UPLC-QTOF-MS脂质组学全定量分析

用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF-MS)对白色和黄色牦牛酥油以及提取的磷脂进行脂质组学分析，用正、负离子模式分别检测了4个样本，发现负离子模式更适合检测磷脂，因此选用负离子模式。负离子模式下牦牛酥油及磷脂脂质组学测定结果见表3。

表3 负离子模式下牦牛酥油及磷脂脂质组学测定结果

续表3

磷脂种类质荷比白酥油/(ng/mL)黄酥油/(ng/mL)白酥油磷脂/(ng/mL)黄酥油磷脂/(ng/mL)PI(18∶1/16∶0)835.53387.381 153.418 509.973 221.16PI(16∶0/18∶1)835.533 443.263 015.4317 593.876 463.13PI(18∶1/18∶2)859.531 322.452 051.6310 410.152 034.56PI(18∶1/18∶1)861.555 549.776 379.9250 749.2719 368.52PI(18∶0/18∶1)863.567 632.006 170.3978 418.1727 397.54PI(18∶1/20∶4)883.531 006.961 608.086 855.835 191.59PI(18∶0/20∶4)885.553 747.563 932.0620 686.698 619.95

注：PC为磷脂酰胆碱， PE为磷脂酰乙醇胺，PG为磷脂酰甘油，PS为磷脂酰丝氨酸，Hex2Cer为二己糖基神经酰胺，PI为磷脂酰肌醇；括号内分别为磷脂结构一位(R1)和二位(R2)所带脂肪酸。

从表3可以看出，在负离子模式下，白酥油、黄酥油、白酥油磷脂和黄酥油磷脂中共检测出5种甘油磷脂(PE、PC、PG、PS、PI)和1种神经酰胺(Hex2Cer)。共鉴定出68种PL，其中PE 30种、PC 17种、PG 3种、PI 7种、PS 5种、Hex2Cer 6种。PE主要集中在m/z662～786区域,PC主要集中在m/z722～854区域,PI主要集中在m/z835～885区域，PS主要集中在m/z784～836区域。在牦牛白酥油中含量最高的是PS(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/22∶5)、PS(18∶0/18∶2)和PC(16∶0/18∶1)，在牦牛黄酥油中含量最多的是PS(18∶0/18∶1)、PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/18∶2)、PE(18∶0/18∶1)和PC(16∶0/18∶1)，在白酥油磷脂中含量最多的是PE(18∶1/18∶1)、PS(18∶0/22∶5)、PS(18∶0/18∶1)、PI(18∶0/18∶1)和PS(18∶0/18∶2)，黄酥油磷脂中含量最多的是PS(18∶0/18∶1)、PS(18∶0/18∶2)、PE(18∶1/18∶1)、PE(18∶0/18∶1)和PS(18∶0/22∶5)。它们的2条脂肪酸链 sn-1/sn-2位多数由18∶0和18∶1组成，所有的脂肪酰基链有14～26个碳，每个链上有0～5个双键。

将表3数据整理分析得到牦牛酥油及其磷脂中6种磷脂的含量分布如图3所示。

图3 负离子模式下4个样本中不同磷脂含量

从图3可以看出，白酥油、黄酥油和白酥油磷脂中PE含量最多，分别占33.35%、35.49%和34.53%，其次为PS，分别占30.66%、33.53%和24.04%，PC分别占21.77%、20.53%和19.81%，PI分别占6.72%、4.51%和15.95%，PG含量最少，分别占1.05%、1.32%和0.67%。而黄酥油磷脂中PS含量最多，占42.71%，其次为PE，占30.26%，PC占12.86%，PI占8.90%，PG含量最少，占2.33%。Hex2Cer在白酥油、黄酥油、白酥油磷脂和黄酥油磷脂中分别占6.45%、4.62%、4.99%和2.94%。

3 结 论

利用不同提取溶剂(乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇、正己烷)提取了白色和黄色牦牛酥油中油脂和磷脂，发现以正己烷为提取剂时油脂和磷脂得率均较高。经GC-MS分析，在白酥油中检出33种脂肪酸，其中饱和脂肪酸22种，不饱和脂肪酸11种，支链脂肪酸6种；在黄酥油中检出32种脂肪酸，其中饱和脂肪酸20种，不饱和脂肪酸12种，支链脂肪酸6种。牦牛酥油磷脂中饱和脂肪酸含量最多，其次是单不饱和脂肪脂肪酸，多不饱和脂肪酸含量最少。但5种溶剂相比较而言，在白酥油和黄酥油中以正己烷为提取剂提取的磷脂中多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量相对较高。通过脂质组学分析，白酥油、黄酥油、白酥油磷脂和黄酥油磷脂在负离子模式下共检测出30种PE、17种PC、3种PG、6种Hex2Cer、5种PS和7种PI。 白酥油、黄酥油和白酥油磷脂中PE含量最多，其次为PS、PC和PI，PG含量最少，而黄磷酥油脂中PS含量最多，其次为PE、PC和PI，PG含量最少。